華蟾毒精對(duì)人結(jié)直腸癌SW-480、HT-29、HCT-116細(xì)胞的放療增敏作用

曹勤洪, 吳震峰, 吳曉宇, 陳徹, 姚學(xué)權(quán), 劉福坤, 陳玉根

新輔助放化療聯(lián)合手術(shù)切除的治療方案能顯著改善局部進(jìn)展期直腸癌患者的局部復(fù)發(fā)和總體生存[1-2]。但由于新輔助放化療反應(yīng)的個(gè)體差異,并不是所有的直腸癌患者都能從新輔助放化療中獲益。腫瘤對(duì)放療耐受的機(jī)制非常復(fù)雜,臨床通過改進(jìn)放療方案、調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)和聯(lián)合其他治療等方法以減少腫瘤對(duì)放療的抵抗[3]。

直腸癌中,目前廣泛應(yīng)用的放療增敏劑為5-FU類化療藥,但其存在一定毒副作用,且療效有限[2]。研究顯示多種中藥有提高放療敏感性的作用[4-5]。華蟾毒精為中華大蟾蜍皮的有效中藥單體提取物,可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[6-7]。華蟾素是中華大蟾蜍的初提物,研究發(fā)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞具有放療增敏作用[8]。華蟾毒精對(duì)于直腸癌的放射治療增敏作用,鮮有報(bào)道。本研究選用人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW-480、HT-29、HCT-116為研究對(duì)象,采用CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖,并用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期和凋亡變化,研究華蟾毒精在人結(jié)直腸細(xì)胞放療中的增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備 SW-480、HT-29、HCT-116細(xì)胞株購于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫;DMEM培養(yǎng)基(批號(hào):AB10104399)購于美國Hyclone公司;華蟾毒精(批號(hào):Z01D7X25885)購于源葉生物;CCK8(批號(hào):EG20161117)購于南京恩晶生物公司;碘化丙啶(批號(hào):BKCA08)購于南京拜睿生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào):KGA108)購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;XD-101型CO2培養(yǎng)箱購于日本Sanyo公司;IX51型生物倒置顯微鏡購于日本Olympus公司;RT-6000型酶標(biāo)儀購于丹麥Radiometer公司;SPECTRA max Plus 384型酶標(biāo)儀購于美國Molecular Devices公司;FACS Calibur型流式細(xì)胞儀購于美國Becton-Dickinson;RS2000Pro型生物輻照儀購于美國Radsource公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 人結(jié)直腸癌SW-480、HT-29、HCT-116細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。分為正常對(duì)照組、X射線輻射組(16 Gy)、華蟾毒精組(華蟾毒精:100 ng/ml)及華蟾毒精和X射線輻射聯(lián)合組(華蟾毒精100 ng/ml處理4 h后,X射線16 Gy輻照30 min)。

1.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,37 ℃,0.25%胰酶(含EDTA)消化細(xì)胞2 min;收集細(xì)胞,1 000 rpm離心5 min;離心后棄上層培養(yǎng)液,加入4 ml新鮮培基,吹打混勻;取細(xì)胞懸液20 μl,加20 μl臺(tái)盼藍(lán)溶液,細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞存活率需在90%以上;顯微鏡計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為4 000個(gè)/100 μl;取96孔板,密度為4 000/孔;置細(xì)胞培養(yǎng)箱,37 ℃,5%CO2培養(yǎng)過夜(16～24 h)。各組細(xì)胞在上述處理后24 h、48 h、72 h取出96孔板,棄去細(xì)胞上層培基,每孔加入100 μl 含0.5%FBS的新鮮培養(yǎng)基,再每孔加入10 μl CCK8,37 ℃孵育4 h。將96孔板放入酶標(biāo)儀,450 nm進(jìn)行讀數(shù)。結(jié)果以細(xì)胞存活率表示表示。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)吸光度-空白孔吸光度)/(對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.4 Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞處理48 h,取出6孔板,把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi),PBS 洗滌貼壁細(xì)胞1次,加入適量胰酶細(xì)胞消化后收集細(xì)胞。用 PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取1×105個(gè)重懸的細(xì)胞,用PBS洗滌2次后加入 500 μl平衡緩沖液,加入5 μl Annexin V-FITC混勻后,加入5 μl碘化丙啶,輕輕混勻。室溫(20～25℃)避光孵育15 min。進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),Annexin V-FITC為綠色熒光,PI 為紅色熒光。FITC的綠色熒光激發(fā)波長(zhǎng)為 488 nm,在 FL1 通道檢測(cè);PI 的紅色熒光在 FL2 通道檢測(cè)。用 Cell Quest 等軟件進(jìn)行分析,繪制雙色散點(diǎn)圖,FL1 為橫坐標(biāo),FL2 為縱坐標(biāo)。每個(gè)樣采集 10 000個(gè)信號(hào)。

1.5 流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期 收集細(xì)胞懸液到離心管內(nèi),4 ℃,1 000 g離心后用預(yù)冷至4 ℃的PBS重懸洗滌3次,加入 1 ml預(yù)冷75%乙醇,4 ℃固定過夜。每個(gè)待檢細(xì)胞樣品中加入500 μl配制好的PI染色工作液,輕輕重懸細(xì)胞沉淀,置于37 ℃避光水浴。用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光,同時(shí)檢測(cè)光散射情況。軟件分析細(xì)胞周期相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 華蟾毒精、X射線及華蟾毒精和X射線聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SW-480、HT-29、HCT-116細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示,與對(duì)照組相比,單獨(dú)X射線輻照和單獨(dú)華蟾毒精給藥,HT-29和HCT-116細(xì)胞的存活率均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),但對(duì)SW-480細(xì)胞的存活率無影響,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);聯(lián)合應(yīng)用華蟾毒精和X射線可降低SW-480、HT-29、HCT-116這3種細(xì)胞的存活率,與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),且聯(lián)合應(yīng)用華蟾毒精和X射線組3種細(xì)胞存活率與單獨(dú)X射線輻照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖1A 華蟾毒精、X射線對(duì)SW-480、HT-29、HCT-116細(xì)胞存活率的影響1A：華蟾毒精組、 X射線組SW-480細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組中SW-480細(xì)胞存活率與對(duì)照組、X射線輻射組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05); 1B:華蟾毒精組、 X射線組及華蟾毒精和X射線聯(lián)合組中HT-29細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組中HT-29細(xì)胞存活率與X射線輻射組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 1C：華蟾毒精組、 X射線組及華蟾毒精和X射線聯(lián)合組HCT-116細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組HCT-116細(xì)胞存活率與X射線輻射組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

2.2 華蟾毒精和X射線聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人結(jié)直腸SW-480、HT-29和HCT-116細(xì)胞凋亡的影響 如表1及圖2所示,與對(duì)照組相比,單獨(dú)華蟾毒精處理(100 ng/ml)和單獨(dú)X射線(16 Gy)均能引起人結(jié)直腸SW-480、HT-29和HCT-116細(xì)胞的凋亡率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與單獨(dú)X射線處理相比,聯(lián)合應(yīng)用華蟾毒精和X射線處理三種細(xì)胞凋亡率均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 華蟾毒精和X射線對(duì)SW-480、HT-29、HCT-116細(xì)胞凋亡的影響

分組凋亡率(%) SW480 對(duì)照組2.27±0.33 華蟾毒精組12.85±0.59? X射線組10.32±0.44? 華蟾毒精+X射線組15.87±0.63?# HT-29 對(duì)照組2.65±0.32 華蟾毒精組32.38±0.77? X射線組6.98±0.37? 華蟾毒精+X射線組16.43±0.69?# HCT-116 對(duì)照組3.14±0.28 華蟾毒精組30.1±0.55? X射線組4.38±0.38? 華蟾毒精+X射線組16.53±0.59?#

注:*為與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);#為與X射線組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期變化 見圖3。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果所示,與對(duì)照組相比,3種細(xì)胞株的相應(yīng)處理組的細(xì)胞周期均發(fā)生了改變,但3種細(xì)胞株的變化并不相同。華蟾毒精處理組與對(duì)照組相比:SW-480細(xì)胞株G1期細(xì)胞比例未發(fā)生改變(P=0.146),見圖3A-2;HT-29細(xì)胞株G1期和S期細(xì)胞比例均發(fā)生改變(G1期:P<0.001;S期:P<0.001),見圖3B-2;HCT-116細(xì)胞株G1期、S期以及G2期細(xì)胞比例均發(fā)生了改變(G1期:P<0.001;S期:P<0.001;G2期:P<0.001),見圖3C-2。

圖2 華蟾毒精和X射線對(duì)SW-480、HT-29、HCT-116細(xì)胞凋亡的影響2A1～2A4:華蟾毒精和X射線對(duì)SW-480細(xì)胞凋亡的影響 2A-1為對(duì)照組,2A-2為華蟾毒精組,2A-3為X射線組,2A-4為華蟾毒精+X射線組;2B1～2B4:華蟾毒精和X射線對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響 2B-1為對(duì)照組,2B-2為華蟾毒精組,2B-3為X射線組,2B-4為華蟾毒精+X射線組;2C1～2C4:華蟾毒精和X射線對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡的影響 2C-1為對(duì)照組,2C-2為華蟾毒精組,2C-3為X射線組,2C-4為華蟾毒精+X射線組

X射線組使SW-480細(xì)胞阻滯于G1期(圖3A-3),聯(lián)合華蟾毒精,仍使細(xì)胞阻滯于G1期(圖3A-4),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>-0.05);X射線使HT-29細(xì)胞阻滯于G2期(圖3B-3),但聯(lián)合華蟾毒精后使細(xì)胞同時(shí)阻滯于G1期和G2期(圖3B-4),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且S期細(xì)胞減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);X射線使HCT-116細(xì)胞阻滯于G1期(圖3C-3),聯(lián)合華蟾毒精時(shí)仍使細(xì)胞阻滯于G1期(圖3C-4),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

如上所述,華蟾毒精對(duì)SW-480細(xì)胞周期影響不明顯,X射線使SW-480細(xì)胞阻滯于G1期,X射線聯(lián)合華蟾毒精組與X射線組的細(xì)胞周期無明顯差異;華蟾毒精使HT-29細(xì)胞主要阻滯于S期,X射線使HT-29細(xì)胞阻滯于G2期,X射線聯(lián)合華蟾毒精使HT-29細(xì)胞阻滯于G1期和G2期,聯(lián)合組與X射線組的細(xì)胞周期相比,G1期細(xì)胞比例顯著增加,而S期細(xì)胞比例明顯減少;華蟾毒精使HCT-116細(xì)胞阻滯于G2期,X射線使HCT-116細(xì)胞阻滯于G1期,X射線聯(lián)合華蟾毒精使HCT-116阻滯于G1期,聯(lián)合組與X射線組細(xì)胞周期相比,無明顯差異。

圖3 華蟾毒精和X射線對(duì)SW-480、HT-29、HCT-116細(xì)胞周期的影響3A-1～3A4:華蟾毒精和X射線對(duì)SW-480細(xì)胞周期的影響3A-1為對(duì)照組;3A-2為華蟾毒精組;3A-3為X射線組;3A-4為華蟾毒精和X射線聯(lián)合組。華蟾毒精組與對(duì)照組相比,G1期、S期和G2期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(G1期:P=0.146;S期:P=0.062;G2期:P=0.133);X射線組與對(duì)照組相比,G1期細(xì)胞比例,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組與X射線輻射組相比,G1期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.232) 3B-1～3B-4:華蟾毒精和X射線對(duì)HT-29細(xì)胞周期的影響3B-1為對(duì)照組;3B-2為華蟾毒精組;3B-3為X射線組。3B-4為華蟾毒精和X射線聯(lián)合組。華蟾毒精組與對(duì)照組相比,G1期和S期細(xì)胞比例,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(G1期:P<0.001;S期:P<0.001),而G2期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.203);X射線組與對(duì)照組相比,G2期細(xì)胞比例,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組與X射線輻射組相比,G1期細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001),且S期細(xì)胞比例,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001) 3C-1～3C-4:華蟾毒精和X射線對(duì)HCT-116細(xì)胞周期的影響3C-1為對(duì)照組;3C-2為華蟾毒精組;3C-3為 X射線組;3C-4為華蟾毒精和X射線聯(lián)合組。華蟾毒精組與對(duì)照組相比,G1期、S期以及G2期細(xì)胞比例,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(G1期:P<0.001;S期:P<0.001;G2期:P<0.001);X射線組與對(duì)照組相比,G1期細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組與X射線輻射組相比,G1期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.201)

3 討論

蟾酥是我國重要的傳統(tǒng)中藥材,臨床應(yīng)用廣泛,可應(yīng)用于止痛、強(qiáng)心及抗腫瘤[9]。蟾酥主要抗腫瘤活性成分為華蟾毒精[10]。華蟾毒精中成藥包括膠囊劑和注射劑,在國內(nèi)已單獨(dú)、聯(lián)合化療或聯(lián)合放療用于多種腫瘤治療。其單獨(dú)應(yīng)用于結(jié)直腸癌[11]、胃癌[12]、肝癌[8,13]體現(xiàn)了明顯的抗癌療效,聯(lián)合放射應(yīng)用于中晚期鼻咽癌[14]、食管癌[15]、肺癌[16],效果亦佳。

體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),華蟾毒精可以增加肝癌Bel-7402細(xì)胞的凋亡,抑制NF-κB 活化,并增強(qiáng)其放療敏感性[8]。在對(duì)食管癌研究中發(fā)現(xiàn),華蟾毒精能通過P73信號(hào)通路抑制細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。而P73可以被酪氨酸激酶c-Abi調(diào)節(jié),并參與放療相關(guān)DNA損傷引起的細(xì)胞凋亡過程[18]。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)華蟾毒精可以通過ROS/MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 而ROS/MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞放療耐受的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。

本研究結(jié)果顯示X射線、華蟾毒精能抑制HT-29及HCT-116細(xì)胞株增殖(P<0.05),但對(duì)SW-480細(xì)胞株抑制作用較弱(P>0.05),說明SW-480對(duì)華蟾毒精及X射線具有耐受性。華蟾毒精和X射線聯(lián)合作用時(shí),不僅放療敏感細(xì)胞株(HT-29、HCT116)的增殖明顯受抑制(P<0.05),而且放療耐受的SW-480細(xì)胞株亦顯示出顯著的增殖抑制作用P<0.05)。而華蟾毒精和X射線聯(lián)合作用時(shí)三種結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖均明顯低于X射線組(P<0.05)。因此華蟾毒精不僅能增加放療敏感結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療敏感性,并且能逆轉(zhuǎn)放療耐受結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療敏感性。本研究還發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,華蟾毒精能增加SW-480[(12.85±0.59)比(2.27±0.33),P<0.05)]、HT-29[(32.38±0.77)比(2.65±0.32),P<0.05)]以及[HCT-116(30.1±0.55)比(3.14±0.28),P<0.05)]的細(xì)胞凋亡,因此華蟾毒精可能通過增加結(jié)直腸細(xì)胞凋亡而起到放療增敏作用。另外,本研究發(fā)現(xiàn)華蟾毒精對(duì)SW-480、HT-29以及HCT-116三種細(xì)胞株的細(xì)胞周期作用并不相同,與對(duì)照組相比,華蟾毒精對(duì)SW-480的細(xì)胞周期影響不明顯(P>0.05),但能使HT-29細(xì)胞阻滯于S期(P<0.05),使HCT-116阻滯于G2期(P<0.05)。如前所述,華蟾毒精對(duì)SW-480的增殖抑制作用不明顯,但能增加SW-480的細(xì)胞凋亡,因此華蟾毒精可能是通過增加SW-480的細(xì)胞凋亡起到放療增敏作用,而非通過細(xì)胞周期抑制作用。而對(duì)于HT-29以及HCT-116細(xì)胞,華蟾毒精可能同時(shí)通過增加細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞周期起到放療增敏作用。

綜上,華蟾毒精能夠增加人結(jié)直腸癌SW-480、HT-29及HCT-116的凋亡,并增強(qiáng)其放療敏感性,可作為結(jié)直腸癌放療的輔助治療。