miR-196b在宮頸癌組織中的表達(dá)意義及其與HPV18的相關(guān)性研究

李會(huì)影, 徐明鑫, 徐明研

宮頸癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。近年來(lái)隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加劇以及生活環(huán)境、飲食習(xí)慣的轉(zhuǎn)變,宮頸癌發(fā)病率和患病率逐年遞增,已成為影響中老年女性人群身心健康和生活質(zhì)量的主要腫瘤疾病[1]。微小RNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子的RNA,其長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸,通過與靶信使RNA的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,引起靶mRNA降解或翻譯抑制,達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)功能的目的。近年來(lái)針對(duì)宮頸癌與miRNA關(guān)系的研究較多。目前臨床已證實(shí)人類乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立高危因素,HPV16、18是常見的HPV感染類型,也是誘發(fā)宮頸癌的主要HPV類型之一,而miR-196則為人體miRNA之一,其可結(jié)合不同靶基因發(fā)揮致癌或抑癌作用[2]。在結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌組織中miR-196的表達(dá)明顯高于正常結(jié)腸組織,因此有學(xué)者認(rèn)為miR-196b的高度表達(dá)可能是評(píng)價(jià)患者預(yù)后結(jié)局的有效客觀指標(biāo)[3-4],而針對(duì)miR-196b與宮頸癌HPV18感染的關(guān)系目前鮮有報(bào)道。本研究選取80例宮頸癌病理標(biāo)本,探討miR-196b在宮頸癌組織中的表達(dá)情況及其與HPV18感染的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2018年1月于牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院確診的80例宮頸癌患者,均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為宮頸癌。排除合并其他部位惡性腫瘤,自身免疫性疾病,精神疾病,既往有宮腔操作、手術(shù)史,接受局部或全身放化療者。本組80例患者年齡35～74(49.5±8.7)歲,FIGO分期為Ⅰ期15例、ⅡA期16例、ⅡB期38例、Ⅲ期11例。獲取80例患者的宮頸癌組織標(biāo)本,同時(shí)選取其周圍健康宮頸黏膜組織標(biāo)本作為對(duì)照。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑 Sanyo -80 ℃超低溫冰箱、高速冷凍離心機(jī)、NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)、BioRad凝膠電泳儀、7500實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀、即用型細(xì)胞和組織總RNA提取試劑(Invitrogen Trizol)、mi-RNA 分析儀(hsa-miR-196b TaqMan MicroRNA Assays)。miR-196b引物序列為TAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG。

1.2.2 檢測(cè)患者HPV18感染情況 采集患者宮頸分泌物,采用薄層液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)患者HPV18感染情況,并據(jù)此檢驗(yàn)結(jié)果將本組80例患者分為HPV18陽(yáng)性組(n=44)與HPV18陰性組(n=36)。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定標(biāo)本組織中miR-196b表達(dá)情況 組織標(biāo)本采集后放入液氮中儲(chǔ)存,保存于-80 ℃超低溫冰箱,先提取總RNA:應(yīng)用高速勻漿機(jī)充分勻漿組織標(biāo)本,加入1 ml TRIzol試劑并嚴(yán)格按照說明書提取總RNA,獲取1 μl RNA并應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳處理20 min,在紫外燈下進(jìn)行攝像分析,并應(yīng)用分光光度計(jì)分別于260、280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值,為A260、A280,計(jì)算RNA含量及A260/A280比值,提取總RNA,應(yīng)用DNase I去除痕量基因組DNA。

然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,RNA量為500 ng,冰上加入5倍緩沖液2 μl、逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl、5倍反轉(zhuǎn)錄引物2 μl、總RNA 1 μl、DEPC水至10 μl,所有試劑加入后于37 ℃反應(yīng)15 min,85 ℃反應(yīng)5 s,0 ℃反應(yīng)5 min,最后于-20 ℃保存。

最后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定:反應(yīng)體系為2×Premix EX Taq 2 μl、2×Taqman MicroRNA Assays 1 μl、cDNA 2 μl、50×ROXⅡ0.4 μl,滅菌水添至20 μl,將反應(yīng)管放置在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀中,設(shè)定條件為95 ℃ 30 s預(yù)變性,PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s,反應(yīng)40個(gè)循環(huán)并應(yīng)用熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)

根據(jù)miR-196b及內(nèi)參U6的RNA擴(kuò)張曲線獲取宮頸癌Ct值,在相對(duì)定量分析中以Ct計(jì)算miR-196b的表達(dá)差異倍數(shù)。為方便統(tǒng)計(jì)分析,宮頸癌中T/N比值≥0.5視為miR-196b高表達(dá),<0.5為miR-196b低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-196b在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與病理特征的關(guān)系

miR-196b在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)值為0.875±0.132,高于正常黏膜組織中的相對(duì)表達(dá)值0.514±0.294,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.617,P<0.05)。在宮頸癌患者中,腫瘤分期高、存在淋巴和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的miR-196b水平較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而不同年齡、腫瘤大小、組織分化程度、浸潤(rùn)深度患者的miR-196b水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

2.2 宮頸癌組織中miR-196b表達(dá)與HPV18感染的關(guān)系

80例宮頸癌中miR-196b高表達(dá)61例(76.25%),低表達(dá)19例(23.75%);HPV18陽(yáng)性組miR-196b高表達(dá)率高于HPV陰性組,ⅡB～Ⅲ分期的miR-196b高表達(dá)率高于Ⅰ～ⅡA分期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表1 80例宮頸癌患者miR-196b表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

病理特征nmiR-196bt值P值 年齡-0.9130.335 >45歲491.412±1.032 ≤45歲312.036±1.285 腫瘤直徑-0.3850.625 >4 cm321.889±1.521 ≤4 cm481.695±1.250 組織分化程度0.9750.625 高50.705±0.052 中711.792±1.317 低41.598±0.049 病理分期-2.9520.002 Ⅰ～ⅡA310.854±0.352 ⅡB～Ⅲ492.182±1.254 浸潤(rùn)深度-0.6200.532 T1+T2221.625±1.395 T3+T4581.795±1.523 淋巴轉(zhuǎn)移-2.9570.002 有422.248±1.622 無(wú)381.003±0.892 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移-2.8710.005 有54.501±0.521 無(wú)751.514±0.852

表2 宮頸癌組織中miR-196b表達(dá)與HPV18感染的關(guān)系

病理參數(shù)nmiR-196b低表達(dá)高表達(dá)χ2值P值 HPV1811.9990.001 陽(yáng)性444(9.1)40(90.9) 陰性3615(41.7)21(58.3) 臨床分期10.9750.001 Ⅰ～ⅡA3112(38.7)19(61.3) ⅡB～Ⅲ494(8.2)45(91.8)

2.3 宮頸癌患者miR-196b表達(dá)情況與生存期關(guān)系

生存分析結(jié)果顯示miR-196b高表達(dá)且HPV18陽(yáng)性患者的生存期明顯短于miR-196b低表達(dá)且HPV18陰性患者或單獨(dú)miR-196b高表達(dá)的患者(Log-rankχ2=5.617,P=0.036),見圖1。

a:miR-196b低表達(dá)且HPV18陰性;b:miR-196b高表達(dá)但HPV18陰性;c:miR-196b低表達(dá)但HPV18陽(yáng)性;d:miR-196b高表達(dá)且HPV18陽(yáng)性圖1 宮頸癌患者生存曲線圖

2.4 miR-196b表達(dá)、HPV18感染與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系

采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行多因素分析結(jié)果顯示,病理分期高、有淋巴轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、miR-196b高表達(dá)且HPV18陽(yáng)性為宮頸癌的危險(xiǎn)因素,見表3。

表3 miR-196b、HPV18與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系

變量OR95%CIP值 年齡1.1980.814～1.7590.347 腫瘤直徑1.3550.918～2.0240.125 分化程度1.3630.913～2.0110.130 病理分期2.4471.652～3.6220.001 浸潤(rùn)深度1.0950.772～1.6750.072 淋巴轉(zhuǎn)移1.7521.157～2.6510.007 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移1.9511.208～2.9580.006 miR-196b高表達(dá)且HPV18陽(yáng)性3.9512.571～6.0620.001

3 討論

miRNA是一種長(zhǎng)度較小的內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNA,其能夠通過對(duì)mRNA的特異性降解以及對(duì)蛋白翻譯的抑制作用,達(dá)到調(diào)控靶基因表達(dá)的目的,其在細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等生物學(xué)進(jìn)程中均具有重要的地位[5]。近年來(lái)的臨床研究還發(fā)現(xiàn),miRNA也具有癌基因與抑癌基因的雙重作用,其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用[6],臨床在對(duì)宮頸癌的miRNA研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌病灶組織中miRNA表達(dá)存在部分異常,有學(xué)者通過對(duì)IB～ⅡA期宮頸癌組織標(biāo)本進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析,發(fā)現(xiàn)70個(gè)miRNA表達(dá)明顯異常,其中68個(gè)miRNA表達(dá)顯著上調(diào),而miR-149、miR-203表達(dá)明顯下調(diào)[7],這些均直接或間接的表明miRNA在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的影響作用[8]。

HPV感染同樣是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要影響因素,其中HPV18型是較常見的HPV感染類型,也是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)最高的HPV類型之一[9],因此研究HPV18感染與miR-196b表達(dá)之間的關(guān)系,對(duì)評(píng)估宮頸癌患者病情、制定治療方案、管理預(yù)后等方面具有重要的臨床意義。本組研究結(jié)果顯示,miR-196b在宮頸癌組織中的表達(dá)量明顯高于正常黏膜組織,腫瘤分期高、存在淋巴和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的miR-196b水平較高,而不同年齡、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、組織分化程度患者的miR-196b水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;80例宮頸癌病理標(biāo)本中miR-196b高表達(dá)率為76.25%,低表達(dá)率為23.75%,HPV18陽(yáng)性組的miR-196b高表達(dá)率明顯高于HPV陰性組, ⅡB～Ⅲ分期的miR-196b高表達(dá)率明顯高于Ⅰ～ⅡA分期,且miR-196b高表達(dá)患者的平均生存時(shí)間明顯短于miR-196b低表達(dá)患者,提示miR-196b高表達(dá)不僅與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),還與HPV18的陽(yáng)性率具有一定的關(guān)系[10-13]。本研究中miR-196b在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào),初步揭示宮頸癌的發(fā)生與miRNA的表達(dá)異常具有一定的相關(guān)性,并且miR-196b與患者的淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期、HPV18感染明顯相關(guān)[14-15],miR-196b的表達(dá)水平也與患者的生存時(shí)間密切相關(guān),表明miR-196b可能是一種重要的宮頸癌預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo),但仍需進(jìn)一步嚴(yán)格的前瞻性研究證實(shí)。

綜上所述,miR-196b高表達(dá)的患者往往預(yù)示其感染HPV18的風(fēng)險(xiǎn)增大,且患者預(yù)后結(jié)局較差、生存時(shí)間縮短,臨床可通過HPV18感染與miR-196b之間的關(guān)系研究,初步評(píng)估患者的病情與預(yù)后結(jié)局,進(jìn)而為臨床針對(duì)性治療提供參考依據(jù)。