環(huán)杷明抑制肝星形細胞激活改善肝纖維化作用實驗研究*

劉翔宇，王凌云

山東省濟寧市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(濟寧 272000)

肝纖維化是肝臟對反復(fù)發(fā)生的慢性肝損傷的治愈過程，包括病毒感染、膽汁淤積性肝病、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝以及一些藥物的副作用[1-3]。其特點是細胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積，形成纖維性瘢痕，引起肝功能障礙，可能發(fā)展為肝硬化和肝癌。幸運的是，如果去除主要的致病因素，肝纖維化是一個可逆的過程，但這總是困難和費時的。目前治療肝纖維化最有效的方法是肝移植。然而，由于器官供體的限制，肝移植并不普及。因此，有必要尋找一種新的治療肝纖維化的藥物，以減輕肝功能障礙和減少并發(fā)癥[4-5]。

對肝纖維化的發(fā)病機制研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細胞(Hepatic stellate cell， HSCs)的活化是其發(fā)病的關(guān)鍵。在健康的肝臟中，HSCs定位于Disse空間，具有靜止表型(qHSCs)[4]；當肝臟損傷刺激后，Kupffer細胞和其他間充質(zhì)細胞被激活并分泌多種促纖維化細胞因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生長因子(PDGF)和表皮生長因子(EGF)，導致肝星狀細胞的激活。激活的HSCs (aHSCs)經(jīng)過一系列的活化反應(yīng)，導致ECM過度積聚和肝纖維化[6]。除ECM沉積外，肝損傷與血管生成有關(guān)。此外，由于組織缺氧，血管生成和纖維生成總是與慢性肝病并行發(fā)展。病理性血管生成加劇了結(jié)構(gòu)紊亂，而不是緩解。據(jù)報道，酪氨酸激酶抑制劑，如舒尼替尼或索拉非尼抑制血管生成，可改善嚙齒類動物的肝纖維化。因此，血管生成也是治療肝纖維化的重要靶點[7]。

環(huán)杷明是一種從藜蘆屬植物中提取的甾體生物堿，在大量的臨床前研究中顯示出了良好的抗癌作用。它是Hedgehog (HH)信號通路的抑制劑。HH信號通路的異常激活導致了多種人類疾病的發(fā)生，如結(jié)直腸癌、肺癌和乳腺癌[8]。臨床上我們發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明對肝纖維化具有調(diào)控作用，但具體調(diào)控作用機制不清楚。因此本研究的目的在于闡明環(huán)杷明對肝纖維化的調(diào)控作用機制。

材料和方法

1 材 料 戊巴比妥鈉鹽、環(huán)杷明、磷酸鹽緩沖液(PBS)、維生素D3、白藜蘆醇、姜黃素購買于Sigma-Aldrich (Merck KGaA)。無水乙醇、二甲苯、Masson染液套裝、分化液、HE染液、 中性樹膠、CCl4購于中國國藥控股國際公司。GAPDH、α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β1、ALT試劑盒和AST試劑盒購于SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY。

2 研究方法

2.1 肝纖維化小鼠模型構(gòu)建和藥物干預(yù)：準備20% CCl4的油劑溶液(CCl4∶橄欖油=1∶4)，3 d一次對小鼠進行皮下注射，注射量按5 ml/kg進行，連續(xù)4周；對照組注射同等劑量橄欖油溶劑。

第4周開始，對模型組分別進行環(huán)杷明5或10 mg/(kg·d)皮下注射、維生素D33 ng/(100g·d)皮下注射、白藜蘆醇200 mg/(kg·d)灌胃、姜黃素 400 mg/(kg·d)灌胃。第8周，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，眼眶取血后常溫放置30 min，1800 r/min離心5 min取上清，冷凍-80℃保存；取肝組織分別進行4%多聚甲醛固定和-80℃冷凍保存。

2.2 生化指標檢測:小鼠血清ALT和AST檢測按照說明書進行操作。

2.3 免疫組化檢測:對固定的肝臟組織進行切片和石蠟包埋，并切成4 μm厚的切片，進行CD31、α-SMA和Masson染色。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2.4 Western blotting:提取總蛋白，標定后進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，然后進行VEGF、CD31、α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1染色，對結(jié)果進行拍照、收集、分析。GAPDH為內(nèi)參蛋白。

3 統(tǒng)計學方法 連續(xù)變量用均數(shù)±標準差表示。使用Graph Pad Prism軟件5.0版(Graph Pad,La Jolla,CA,USA)對多組比較進行單向方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 環(huán)杷明可顯著抑制CCl4誘導的肝損傷和纖維化 對導致肝損傷的血清標記蛋白ALT和AST進行檢測發(fā)現(xiàn)，相對對照組，CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型血清中ALT和AST表達上調(diào)，環(huán)杷明、維生素D3、白藜蘆醇、姜黃素等治療后均可抑制ALT和AST表達(P<0.001)，其中環(huán)杷明治療效果最好，且環(huán)杷明10 mg/kg濃度治療效果好于5 mg/kg。提示環(huán)杷明治療可顯著降低CCl4誘導的小鼠肝損傷，如圖1A和1B所示。對肝組織進行Masson染色發(fā)現(xiàn)，CCl4誘導下顯著促進了膠原蛋白沉積，環(huán)杷明、維生素D3、白藜蘆醇、姜黃素等治療后均可抑制膠原蛋白沉積，其中環(huán)杷明治療效果最好，且環(huán)杷明10 mg/kg濃度治療效果好于5 mg/kg。提示環(huán)杷明治療可顯著降低CCl4誘導的小鼠肝纖維化。如圖1C所示。

2 環(huán)杷明可顯著抑制肝星狀細胞激活和肝血管生成 對肝組織中血管形成標記蛋白CD31進行檢測發(fā)現(xiàn)，相對對照組，CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型肝組織中CD31表達上調(diào)，環(huán)杷明治療后可顯著抑制肝組織中CD31表達，且環(huán)杷明10 mg/kg濃度治療效果好于5 mg/kg (P<0.001)。如圖2A和2B所示。對導致肝損纖維化的肝星狀細胞激活標記蛋白α-SMA進行檢測發(fā)現(xiàn)，相對對照組，CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型肝組織中α-SMA表達上調(diào)，環(huán)杷明治療后可顯著抑制肝組織中α-SMA表達，且環(huán)杷明10 mg/kg濃度治療效果好于5 mg/kg。如圖2A和2C所示(P<0.001)。提示環(huán)杷明治療可顯著降低CCl4誘導的小鼠肝組織中血管生成和肝星狀細胞激活。

圖1 ELISA檢測血清中ALT(A)、AST(B) 表達及肝組織纖維化(C)

圖2 免疫組化檢測肝組織中CD31、α-SMA表達(A)及對CD31(B)、α-SMA(C)相對表達量的統(tǒng)計學分析

3 環(huán)杷明可顯著抑制血管形成和纖維化相關(guān)蛋白表達 見圖3。相對對照組，CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型肝組織VEGF表達上調(diào)，環(huán)杷明可顯著抑制肝組織VEGF表達，且環(huán)杷明10 mg/kg療效好于5 mg/kg。對α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1檢測發(fā)現(xiàn)，相對對照組，CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型肝組織中α-SMA、Collagen Ⅰ和TGF-β1表達上調(diào)，環(huán)杷明治療可顯著抑制肝組織中α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1表達，且環(huán)杷明10 mg/kg療效好于5 mg/kg。提示環(huán)杷明治療可顯著降低CCl4誘導的小鼠肝組織中血管生成和纖維化。

圖3 Western blot檢測肝組織中VEGF、α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1表達

討 論

肝纖維化是一個世界性的嚴重健康問題，因為肝纖維化是一切慢性肝病的基礎(chǔ)，最終會發(fā)展為肝硬化，甚至是肝癌[9]。目前常見的纖維化方法有免疫抑制劑、抗炎因子、PPARγ受體激動劑等[10]。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展和逆轉(zhuǎn)過程中，肝星狀細胞活化，成為肌成纖維細胞活化和增殖的最大貢獻者[11]。在正常肝臟中，肝星狀細胞維持ECM的產(chǎn)生和降解，維持ECM沉積的平衡，然而，在肝纖維化中，靜止狀態(tài)下的肝星狀細胞過度激活成激活狀態(tài)的肝星狀細胞，導致了ECM的過度沉積，特別是膠原蛋白[12]。

HH信號通路由三種HH 配體即Sonic hedgehog(Shh)、India hedgehog(Ihh)和 Desert hedgehog(Dhh)，兩個跨膜受體蛋白Patched (Ptch)1 和Smoothened (Smo)，以及三個核轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2和 Gli3組成[13]。有實驗表明，在HSC活化過程中HH信號通路被激活，而抑制HH信號的活性可導致HSC的增殖被抑制且分化過程被部分阻止[14]。同時活化的Gli還能通過激活PDGF、TGFβ/Smad等信號通路，促進HSC的活化[14]。目前發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明可抑制HH信號通路中的 Smo蛋白[13]；姜黃素能阻斷HH、ERK信號通路[15]；白藜蘆醇可抑制HH信號通路成員Gli1、Ptch和 cyclin D1mRNA的表達[16]，維生素D亦有抑制Hh信號通路致GLi1表達下調(diào)的作用[17]。

本課題研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)杷明、維生素D3、白藜蘆醇和姜黃素均可有效降低CCl4誘導的小鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平(AST、ALT)，同時抑制肝組織纖維化。證實環(huán)杷明抑制了VEGF介導的血管生成，同時環(huán)杷明可抑制TGF-β1等誘導的肝星狀細胞活化和ECM沉積，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進展。有研究表明，環(huán)杷明的抗纖維化作用與其抑制HH信號通路有關(guān)，白藜蘆醇、姜黃素、維生素D3亦有抑制HH信號通路的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)杷明的抗纖維化作用與劑量成正相關(guān)，高劑量的白藜蘆醇、姜黃素、維生素D3是否能提高抗纖維化的作用及在人體內(nèi)的合適劑量仍需進一步研究。