QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法同時測定果蔬中19種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留

姚恬恬， 劉 翻， 金 鑫， 柳英霞， 萬益群,， 郭 嵐*,

(1.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌 330031 2.南昌大學(xué)分析測試中心，江西南昌 330047)

植物生長調(diào)節(jié)劑(Plant Growth Regulators,PGRs)是一類用于調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的農(nóng)藥[1]，它們可以增強作物的抗逆性，縮短蔬菜、水果的成熟期，提高產(chǎn)量及改善品質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。但植物生長調(diào)節(jié)劑與其他農(nóng)藥一樣也具有一定的毒性[2]，如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)具有急性神經(jīng)毒性，對皮膚和眼睛有刺激作用，對肝腎有損害[3]；多效唑?qū)π坌陨称鞴儆袚p傷，有可能是致癌物質(zhì)[4 - 5]；丁酰肼的水解產(chǎn)物二甲基聯(lián)氨是一種潛在的致癌物等[6]。近年來，濫用及不當使用植物生長調(diào)節(jié)劑的現(xiàn)象時有發(fā)生，已影響到農(nóng)產(chǎn)品的食用安全，對人民健康造成威脅。因此，開展果蔬中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的快速檢測新技術(shù)研究，對保證食品安全、促進國民健康及社會經(jīng)濟發(fā)展都有十分重要的現(xiàn)實意義。

我國關(guān)于植物生長調(diào)節(jié)劑的多殘留檢測技術(shù)和有關(guān)限量標準的基礎(chǔ)研究還處于發(fā)展初期，多殘留同時檢測的國家標準尚未建立[7 - 8]。由于食品基質(zhì)復(fù)雜，而植物生長調(diào)節(jié)劑種類繁多，化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)各異，且殘留水平較低，因此需要采用更有效地樣品前處理技術(shù)和更為靈敏的檢測方法來進行植物生長調(diào)節(jié)劑多殘留分析檢測。目前，植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的檢測方法有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[9]、毛細管電泳法(CE)[10]、離子色譜法(IC)[11]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[12]、高效液相色譜法(HPLC)[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[14 - 18]和液相色譜-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法(LC-Q -TOF-MS/MS)[19 - 20]。這些方法各具特色，ELISA法只能測定單一化合物，且假陽性高；CE法的靈敏度雖高，但重現(xiàn)性較差；GC-MS法分析植物生長調(diào)節(jié)劑，往往需要衍生，操作比較繁瑣，周期長；IC和HPLC法的靈敏度較低；LC-MS/MS法靈敏度高，專屬性好，是目前植物生長調(diào)節(jié)劑的主要分析方法。LC-Q-TOF/MS/MS法作為高分辨質(zhì)譜技術(shù)的代表，在質(zhì)量數(shù)精度、全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)可溯源性和數(shù)據(jù)庫檢索等方面有著低分辨質(zhì)譜無可比擬的優(yōu)勢，已越來越多地應(yīng)用于多農(nóng)殘檢測領(lǐng)域[21 - 22]，但目前文獻報道涉及植物生長調(diào)節(jié)劑殘留分析的種類較少，難以滿足食品安全監(jiān)測工作的需要。

QuEChERS方法具有快速、簡便、經(jīng)濟、高效、穩(wěn)定和可靠等特點，自2003年引入以來，被廣泛用作多殘留分析中的樣品制備技術(shù)[23 - 24]。本文采用QuEChERS法結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，優(yōu)化了樣品前處理方法以及色譜-質(zhì)譜分析條件，考察了基質(zhì)效應(yīng)，建立了果蔬中19種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Triple TOFTM5600+四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國，AB SCIEX公司)；UPLC 30A高效液相色譜儀(日本，島津公司)；TGL-16G高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；MS3渦旋混勻器(德國，IKA公司)；DSY-V氮吹濃縮儀(北京東方精華苑)；JJ-2組織搗碎勻漿機(常州國華儀器有限公司)；PULSE-Analytic超純水裝置(英國，ELGA公司)。

19種植物生長調(diào)節(jié)劑標準品：赤霉酸、脫落酸、吲哚丙酸、對氯苯氧乙酸、噻苯隆、4-碘苯氧基乙酸、調(diào)果酸、2，4-D、萘乙酸、氯吡脲、抗倒胺、環(huán)丙酸酰胺、吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、吲哚丁酸、抗倒酯、多效唑、烯效唑、抑芽唑(純度≥99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)。標準溶液的配制：分別準確稱取10 mg各標準品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，配制成1 mg/mL 的單標準儲備液，4 ℃保存。根據(jù)需要配制系列質(zhì)量濃度的混合標準工作溶液。乙腈、甲醇(色譜純，德國默克公司)；甲酸(色譜純，美國TEDIA公司)；NH4Ac(色譜純，美國ACS公司)；HAc、NaCl、無水MgSO4均為分析純(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；吸附劑：C18、石墨化炭黑(GCB)和N-丙基乙二胺(PSA)均購自上海安譜公司。水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 樣品前處理

將果蔬樣品去皮后勻漿，準確稱取10 g勻漿后的樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL HAc-乙腈溶液(1∶99,V/V)，同時加入4 g無水MgSO4和1 g NaCl，3 000 r/min渦旋3 min，以4 000 r/min離心10 min。取10 mL上清液于50 mL離心管中，加入150 mg無水MgSO4和700 mg C18+25 mg GCB+50 mg PSA組合凈化劑，以3 000 r/min渦旋3 min，再以4 000 r/min離心10 min。取5 mL上清液于玻璃試管中，于40 ℃水浴中氮吹濃縮至近干，殘余物用1 mL甲醇超聲溶解后，過0.22 μm濾膜，供UPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

1.3 色譜分離條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18柱(75×2.1 mm，2.0 μm)；流動相：A相為水(含5 mmol/L NH4Ac和0.1%甲酸)，B相為甲醇。梯度洗脫程序：0 min，5%B；3 min，60%B；16 min，70%B；16.1 min，80%B，保持2 min。流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI和APCI復(fù)合源；正負離子掃描方式；氣簾氣(CUR)30 psi；霧化氣(GAS 1)50 psi；輔助氣(GAS 2)50 psi；離子源溫度550 ℃。一級質(zhì)譜：掃描范圍100～450 Da；數(shù)據(jù)采集時間100 ms；去簇電壓(DP)80 V；碰撞能(CE)10 V。二級質(zhì)譜：掃描范圍40～450 Da。19種植物生長調(diào)節(jié)劑的定性、定量離子、噴霧電壓(ISVF)、去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)詳見表1。

表1 19種植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)和保留時間

(續(xù)表1)

No.PGRsRetentiontime(min)Ion modePrecursor ionTheoretical(m/z)Found(m/z)Relativedeviation(10-6)Productions(m/z)ISVF(V)DP(V)CE(V)44-Chlorophenoxyacetic acid6.91-185.0011185.00110.2126.9979*4 50016205Thidiazuron7.13-219.0346219.03491.499.9992*70.98414 500142064-Iodophenoxyacetic acid7.62-276.9367276.93690.8218.9354?126.90654 50019307Cloprop7.87-199.0167199.0165-0.8126.9983*4 500162082,4-Dichlorophenoxyacetic acid8.00-218.9621218.96220.4160.9600*4 50015259Naphthylacetic acid8.04-185.0608185.0607-0.5141.0730*4 500121510Forchlorfenuron8.63-246.0440246.0439-0.4127.0095*91.03154 500151511Inabenfide9.86-337.0749337.0748-0.5231.0381122.0275*4 5002411512Cyclanilide11.78-271.9887271.98901.5229.0039159.9762*4 500213013Indole-3-acetic acid6.25+176.0706176.0705-0.4130.0783*5 5008018146-Benzyladenine6.56+226.1087226.10901.391.0634*65.04445 50010033153-Indolebutyric acid7.39+204.1019204.1017-0.8186.1111*168.08335 500852216Trinexapac-ethyl8.84+253.1071253.10710.2207.086969.0403*5 500902017Paclobutrazol10.40+294.1368294.13690.4125.027570.0471*5 500853318Uniconazole13.03+292.1211292.12120.3125.027170.0466*5 5001152619Triapenthenol13.41+264.2070264.20720.8109.111570.0471*5 5008035

*quantitative product ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件的選擇

分別以甲醇-5 mmol/L NH4Ac水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-5 mmol/L NH4Ac-0.1%甲酸水溶液為流動相，考察三者對19種待測物峰形、離子化效率及分離度的影響。結(jié)果表明，以甲醇-5 mmol/L NH4Ac-0.1%甲酸水溶液為流動相，采用梯度洗脫，19種植物生長調(diào)節(jié)劑靈敏度較高，且分離度和峰形都比較好。19種植物生長調(diào)節(jié)劑的MRM色譜圖見圖1。

圖1 19種植物生長調(diào)節(jié)劑MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the 19 PGRs mixed standard solution1.Gibberellic acid(0.25 mg/L);2.Abscisic acid(0.25 mg/L);3.3-Indolepropionic acid(1.25 mg/L);4.4-Chlorophenoxyacetic acid(0.25 mg/L);5.Thidiazuron(0.05 mg/L);6.4-Iodophenoxyacetic acid(0.25 mg/L);7.Cloprop(0.2 mg/L);8.2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(0.25 mg/L);9.Naphthylacetic acid(1.25 mg/L);10.Forchlorfenuron(0.05 mg/L);11.Inabenfide(0.05 mg/L);12.Cyclanilide(0.2 mg/L);13.Indole-3-acetic acid(0.25 mg/L);14.6-Benzyladenine(0.2 mg/L);15.3-Indolebutyric acid(0.25 mg/L);16.Trinexapac-ethyl(0.25 mg/L);17.Paclobutrazol(0.25 mg/L);18.Uniconazole(1.25 mg/L);19.Triapenthenol(0.25 mg/L).Note:1-12 were in negative mode,13-19 were in positive mode.

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖2 不同提取溶劑對19種植物生長調(diào)節(jié)劑的提取效率(n=3)Fig.2 Extraction efficientcy of the 19 PGRs with different extraction solvents(n=3)a.acetonitrile;b.acetic acid-acetonitrile(1∶99,V/V);c.methanol-acetonitrile(1∶1,V/V);d.acetic acid-methanol-acetonitrile(1∶50:49,V/V).1-19:the numbers are consistent with Fig.1.

分別在正、負離子模式下進行全掃描，掃描范圍m/z40～400，得到19種植物生長調(diào)節(jié)劑的一級質(zhì)譜圖。對比正、負離子兩種模式下的響應(yīng)強度，為19種化合物分別確定其合適的離子模式，以達到最高的電離效率。選擇準分子離子為母離子，在10～120 V的范圍內(nèi)分別優(yōu)化其去簇電壓(DP)，以獲得最強的母離子信號。在此基礎(chǔ)上對各個物質(zhì)進行二級質(zhì)譜掃描，得到碎片離子信息，選擇豐度相對較高和相對分子質(zhì)量較大的碎片離子作為定量離子和定性離子，優(yōu)化碰撞能(CE)，建立多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。優(yōu)化后的Q-TOF-MS/MS參數(shù)如表1所示。

2.3 提取溶劑的選擇

比較了乙腈、HAc-乙腈溶液(1∶99,V/V)、甲醇-乙腈溶液(1∶1,V/V)、HAc-甲醇-乙腈溶液(1∶50∶49,V/V)4種提取溶劑對19種植物生長調(diào)節(jié)劑的提取效果，結(jié)果見圖2。實驗結(jié)果表明，采用HAc-乙腈(1∶99,V/V)為提取溶劑，19種植物生長調(diào)節(jié)劑的回收率在75%～105%之間，優(yōu)于其他3種提取溶劑。而且對于吲哚乙酸、吲哚丁酸、吲哚丙酸、調(diào)果酸、赤霉酸等酸性物質(zhì)，添加了1%HAc的提取溶劑的提取效率明顯提高。這是由于酸性條件下抑制了羧基的電離，從而增加了酸性物質(zhì)在有機溶劑中的溶解度。另外，實驗還發(fā)現(xiàn)使用乙腈作為提取溶劑時，共提物明顯比用甲醇作提取溶劑的少，因此本實驗最終選擇HAc-乙腈(1∶99,V/V)為提取溶劑。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

圖3 19種植物生長調(diào)節(jié)劑在不同凈化劑組合中的回收率(n=3)Fig.3 Recoveries of the 19 PGRs with different purification agent combinations(n=3) 1-19:the numbers are consistent with Fig.1.

與傳統(tǒng)的固相萃取方法不同，QuEChERS法采用適當?shù)奈絼?，通過非極性相互作用、極性相互作用、離子相互作用等選擇性保留基質(zhì)中雜質(zhì)組分，從而達到凈化的效果。果蔬基質(zhì)的共提物主要包括色素、糖類和有機酸等，常用C18、PSA和GCB進行凈化[25]。在3種吸附劑中，PSA是一種弱陰離子交換劑，能有效消除提取物中脂肪酸和有機酸的干擾，但對分子結(jié)構(gòu)中含羧基的化合物也有一定的吸附作用；GCB可有效去除色素；C18對非極性物質(zhì)有很強的吸附作用。實驗結(jié)果表明，GCB對色素的凈化效果最好，其次是PSA，但兩者對一些目標化合物有吸附作用，平均加標回收率分別為61.8%和80.6%；而C18能明顯減少提取物中基質(zhì)，而且?guī)缀醪晃侥繕嘶衔铮骄厥章蕿?05%，但去除色素效果并不明顯。因此實驗以C18為主要凈化劑，加入適量的GCB和PSA，以提高凈化效果，同時對目標化合物吸附量最少。選擇40 μg/L的加標濃度，考察了(a)800 mg C18+25 mg GCB、(b)700 mg C18+25 mg GCB+50 mg PSA和(c)500 mg C18+25 mg GCB+100 mg PSA 3種條件下的凈化效果和加標回收率，結(jié)果見圖3。其中采用700 mg C18+25 mg GCB+50 mg PSA為凈化劑時，19種目標化合物的回收率在75%～118%之間，而且去除色素等基質(zhì)的效果較好，因此最終選擇組合(b)為本實驗的凈化劑。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量限

在質(zhì)譜分析技術(shù)中，基質(zhì)效應(yīng)是一個常見干擾因子，指樣品共提物的基質(zhì)會影響目標物的離子化，造成目標物在質(zhì)譜上的響應(yīng)發(fā)生增強或抑制的現(xiàn)象。對其進行合理的評價，并采取適當?shù)姆椒p少或消除，可以提高測定準確度。文獻報道多采用基質(zhì)匹配校準方法[26 - 27]和同位素內(nèi)標定量方法[28]，而前者更為經(jīng)濟。本文采用相對響應(yīng)值法(基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)標準響應(yīng)值/純?nèi)軇藴薯憫?yīng)值)評價了19種植物生長調(diào)節(jié)劑在不同果蔬中的基質(zhì)效應(yīng)，同時還比較了目標物在基質(zhì)和純?nèi)軇┲斜Ａ魰r間的差異，見表2。實驗結(jié)果顯示，19種化合物在純?nèi)軇┖突|(zhì)中的保留時間偏差小于2%，基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)超過0.80～1.20范圍的目標物數(shù)目在橙、葡萄、黃瓜中分別為9、9和1，表明果蔬中的基質(zhì)效應(yīng)不可忽略。本實驗最終采用空白基質(zhì)配制標準工作溶液，在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下進行分析，以峰面積(Y)對濃度(c)繪制基質(zhì)校準曲線，并計算其檢出限和定量限，見表2。結(jié)果表明，19種化合物線性關(guān)系良好，其檢出限和定量限遠低于各國現(xiàn)行殘留限量標準，可用于實際樣品檢測。

表2 19種植物生長調(diào)節(jié)劑的基質(zhì)效應(yīng)、在基質(zhì)與純?nèi)軇┲械谋Ａ魰r間偏差、在基質(zhì)中的線性關(guān)系、檢出限和定量限

(續(xù)表2)

PGRs No.?SampleLinear equationLinear range(μg/L)Retention timedeviation(%)Matrix effectR2LODs(μg/kg)LOQs(μg/kg)18Orangey=2.07×102c-63410-50001.230.99990.51.7Cucumbery=5.41×102c-3885-5000.0740.931.00000.290.98Grapey=6.02×102c-8305-5000.380.990.99980.040.1419Orangey=4.15×103c-202055-500-0.700.550.99930.040.11Cucumbery=8.34×103c-186265-5000.0961.010.99960.070.23Grapey=1.16×104c-251885-5000.301.280.99990.080.27

*:the numbers are consistent with Fig.1.

2.6 加標回收率和精密度

為了進一步評估該方法的準確度和精密度，對橙、黃瓜和葡萄分別進行了加標回收實驗。每種化合物添加3個濃度水平，每個水平做6個平行樣品，然后按1.2進行樣品前處理，在1.3和1.4的色譜和質(zhì)譜條件下，基質(zhì)標準溶液外標法測定，平均回收率和相對標準偏差(RSD)見表3。19種植物生長調(diào)節(jié)劑在3個添加水平的平均回收率在70.1%～116.2%之間，RSD小于10.6%，表明方法具有良好的準確度和精密度。

表3 橙子、黃瓜和葡萄中19種植物生長調(diào)節(jié)劑的加標回收結(jié)果(n=6)

(續(xù)表3)

PGRs No.?Spiked level(μg/kg)OrangeCucumberGrapeRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)141073.92.473.75.071.53.15074.93.287.55.071.46.910076.13.475.12.482.85.7151092.15.689.16.496.43.45080.04.193.33.588.84.110088.41.995.53.3100.63.91610115.23.396.44.684.44.35084.35.380.02.691.43.710085.77.292.42.689.15.0171090.15.090.64.6102.13.550112.12.884.58.9109.53.510089.55.695.33.4101.24.0181081.17.895.66.395.73.850109.62.890.85.598.44.810083.62.795.22.1104.83.9191082.05.997.85.582.93.85080.93.393.53.290.03.210076.81.9113.52.7105.05.3

*:the numbers are consistent with Fig.1.

圖4 葡萄樣品的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of grape sample

2.7 樣品的測定

應(yīng)用所建立的分析方法對南昌市售的15批橙、黃瓜和葡萄樣品進行分析，樣品的MRM色譜圖見圖4。在15批樣品中檢測到7種植物生長調(diào)節(jié)劑：赤霉酸、噻苯隆、氯吡脲、吲哚乙酸、多效唑、烯效唑和脫落酸，其中前6種含量在0.14～13 μg/kg之間，而脫落酸在10批樣品中均有檢出，含量在6.7～415.4 μg/kg范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

建立了果蔬樣品中19種植物生長調(diào)節(jié)劑的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析方法。樣品采用QuEChERS前處理技術(shù)，經(jīng)酸化乙腈提取，C18、PSA和GCB聯(lián)合凈化，利用保留時間和高分辨質(zhì)譜獲得的母離子與子離子的精確質(zhì)量數(shù)對化合物進行定性；MRM模式監(jiān)測，基質(zhì)標準溶液外標法進行定量。本方法簡單快速、靈敏度高，準確度和精密度都滿足方法學(xué)指標，可用于果蔬中19種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留分析。