Streptomyces alboflavus抗真菌物質(zhì)對串珠鐮刀菌的抑制機(jī)理研究

王志芳, 李貞景, 楊明冠, 路來風(fēng)， 王昌祿，*, 李 政,張健飛, 鞏繼賢

(1.天津工業(yè)大學(xué) 分析測試中心， 天津 300387；2.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室， 天津 300457；3.天津工業(yè)大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院， 天津 300387)

鐮刀菌是世界性分布的一類真菌，可侵染達(dá)100余種植物，引起植物的根腐、莖腐、花腐和穗腐等多種病害[1-2]。鐮刀菌侵染寄主植物維管束系統(tǒng)，破壞植物的輸導(dǎo)組織維管束，并產(chǎn)生毒素，造成作物萎蔫死亡，屬于生產(chǎn)上最難防治的重要病害之一。鐮刀菌在世界范圍內(nèi)造成許多毀滅性的植物病害，如串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)造成香蕉萎蔫病，禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)造成頸腐病等[3-5]。串珠鐮刀菌還會污染玉米、高粱、小麥、棉花及某些飼料等，為非專性、非宿主特異性病原菌，其水溶性代謝產(chǎn)物伏馬菌素(fumonisin)，還可以引起動物各種疾病，如馬腦白質(zhì)軟化癥、豬肺水腫或大鼠肝癌[6-7]。采用生物防治手段對有害霉菌及其毒素進(jìn)行防控，對環(huán)境污染小，符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略方向，受到國內(nèi)外科學(xué)家關(guān)注。

鏈霉菌是重要的生防菌株，利用鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝物開發(fā)抑菌劑具有天然、安全、抑菌效果好等特點，被廣泛用于農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域[8-10]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，研究者們在極端環(huán)境微生物、新菌種篩選、新物質(zhì)分離等方面取得了一定的成果。鏈霉菌具有產(chǎn)生多種次級代謝物的能力，對尋找具有新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)及開發(fā)新作用機(jī)理的抗菌藥物生物活性資源具有重要意義[11-14]。

Streptomycesalboflavus是從土壤中篩選到的一株拮抗菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC No. 4666)，16S rDNA在NCBI注冊登錄號為JX915780，鑒定為白黃鏈霉菌。對峙培養(yǎng)法研究發(fā)現(xiàn)，該菌對黃曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)、純綠青霉(Penicilliumverrucosum)、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)等常見重要植物病原菌具有廣譜拮抗作用，尤其對串珠鐮刀菌的抑制效果最好，且還會產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)[15-16]。為進(jìn)一步研究Streptomycesalboflavus產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)，本研究對其產(chǎn)生的胞內(nèi)抗菌物質(zhì)進(jìn)行定性分析，并研究其活性物質(zhì)對串珠鐮刀菌的抑菌機(jī)理，希望為利用鏈霉菌開展鐮刀菌的生物防治技術(shù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌株和培養(yǎng)基

拮抗菌株：拮抗鏈霉菌菌株Streptomycesalboflavus，本實驗室自天津市寶坻區(qū)飼料廠儲糧倉周圍的土壤中篩選分離獲得并保藏。供試菌株：串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)，由天津市畜牧獸醫(yī)研究所提供。

供試培養(yǎng)基：高氏一號液體培養(yǎng)基，用于Streptomycesalboflavus發(fā)酵液的培養(yǎng)；PDA培養(yǎng)基，用于指示菌串珠鐮刀菌的培養(yǎng)及拮抗活性的測定。

1)高氏一號合成培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉，20.0 g；NaCl，0.5 g；FeSO4·7H2O，0.01 g；MgSO4·7H2O，0.5 g；KNO3，1 g；K2HPO4，0.5 g；瓊脂，20 g；自來水，1 000 mL；調(diào)節(jié)pH值7.2～7.4。

2)高氏一號液體培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉，20.0 g；黃豆粉，10.0 g；KNO3，1.0 g；K2HPO4，0.5 g；NaCl，0.5 g； MgSO4·7H2O，0.5 g；FeSO4·7H2O，0.01 g；自來水，1 000.0 mL；pH值7.2～7.4。

3)PDA培養(yǎng)基配方：稱取去皮馬鈴薯200.0 g，切成小塊，加入1 000.0 mL水，煮沸30 min，用雙層紗布濾成清液。加水至1 000.0 mL，然后加入20.0 g葡萄糖至完全溶解，pH值自然。

4)查氏培養(yǎng)基配方：NaNO3，3.0 g； K2HPO4，1.0 g；MgSO4·7H2O，0.5 g；KCl，0.5 g；FeSO4·7H2O，0.01 g；蔗糖，30.0 g；蒸餾水，1 000 mL；pH值自然。

1.1.2原料和試劑

黃豆粉，食品級，天津市售黃豆粉；硫酸亞鐵、硫酸鎂，化學(xué)純，天津市化學(xué)試劑一廠；可溶性淀粉、氯化鈉、硝酸鉀，分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；膽固醇(質(zhì)量比94%)、麥角甾醇(質(zhì)量比大于75%)，Sigma-aldrich公司；葡聚糖(質(zhì)量比大于97%)，百特純大分子科技有限公司；殼聚糖(質(zhì)量比大于85%)，湖北圣天宇公司；硅膠G、硅膠H，青島海洋化工廠；葡聚糖凝膠LH- 20，Pharmacia公司。

1.2 儀器和設(shè)備

LS- B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；KCL2000型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，日本Eyela東京理化公司；AG22331型高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司； CX41型生物顯微鏡、BX- 60型熒光顯微鏡，Olympus公司；SU- 1510型掃描電子顯微鏡，Hiachi公司。

1.3 實驗方法

1.3.1Streptomycesalboflavus的發(fā)酵培養(yǎng)

將Streptomycesalboflavus菌株劃線于高氏一號固體培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行活化， 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，制備1×106CFU/mL孢子懸液，按體積分?jǐn)?shù)10%添加量加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)6 d。

1.3.2Streptomycesalboflavus中抑菌活性物質(zhì)的分離純化

用8層紗布過濾發(fā)酵液，得到鏈霉菌菌絲體。甲醇浸提菌絲體，將浸提液減壓濃縮，粗提物經(jīng)萃取、硅膠吸附柱層析、葡聚糖凝膠LH- 20柱層析分離純化，得到脂溶性抑菌組分。

1.3.3抑菌活性物質(zhì)檢測方法

采用牛津杯法測定抑菌物質(zhì)的生物活性。將串珠鐮刀菌的孢子懸浮液接種于PDA培養(yǎng)基中，然后放置3個牛津杯，將活性物質(zhì)加入一個牛津杯，其余兩個作為空白對照組，培養(yǎng)3 d。

1.3.4抑菌活性物質(zhì)pH紙層析

以新華一號層析紙為固定相，用pH值為2.2～8.0的磷酸氫二鈉- 檸檬酸緩沖液及pH值9～10的甘氨酸- 氫氧化鈉溶液分別處理各濾紙條，晾干后備用。在每個pH值的濾紙條上一端標(biāo)記起點，取抑菌物質(zhì)20 μL進(jìn)行點樣，晾干后分別在水飽和的正丁醇、水飽和的乙酸乙酯、體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇中展層，用生物學(xué)顯跡法測遷移率Rf值，具體方法見參考文獻(xiàn)[17]。

1.3.5抑菌活性物質(zhì)Doskochilova溶劑紙層析

溶劑系統(tǒng)：Ⅰ.水飽和的正丁醇；Ⅱ.水飽和的正丁醇，內(nèi)含質(zhì)量比2%的對甲苯磺酸；Ⅲ.V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)為2∶1∶1；Ⅳ.水飽和的正丁醇，內(nèi)含質(zhì)量比2%的六氫吡啶；Ⅴ.正丁醇飽和的0.5 mol/L、pH值為7的磷酸緩沖液；Ⅵ.正丁醇飽和的水，內(nèi)含質(zhì)量比2%的對甲苯磺酸；Ⅶ.V(苯)∶V(甲醇)為4∶1，濾紙先用磷酸緩沖液處理后晾干；Ⅷ.V(甲醇)∶V(水)為3∶1，水內(nèi)含質(zhì)量比3%的NaCl，濾紙先用質(zhì)量比5%的Na2SO4處理后晾干。用生物學(xué)顯跡法測遷移率Rf值，具體方法見參考文獻(xiàn)[17]。

1.4 抑菌物質(zhì)對菌絲形態(tài)影響的觀察

1.4.1光學(xué)顯微鏡觀察

采用牛津杯法檢測抑菌物質(zhì)的抑菌活性，挑取由抑菌物質(zhì)作用產(chǎn)生的透明圈的邊際菌絲，光學(xué)顯微鏡觀察。挑取未受到抑制作用的菌絲作為對照。

1.4.2熒光顯微鏡觀察

將1×106CFU/mL的串珠鐮刀菌孢子懸浮液接種于察氏液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。將串珠鐮刀菌的培養(yǎng)液以轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，離心10 min，棄上清液，用抑菌物質(zhì)溶液輕輕懸浮菌絲15 min，去離子水清洗后，用碘化丙啶(PI)染色后，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。對照組菌絲用體積比為50%甲醇(配制抑菌物質(zhì)的溶液)處理。激發(fā)光波長450～490 nm，發(fā)射光波長520 nm。

1.4.3掃描電子顯微鏡觀察

采用牛津杯法檢測抑菌物質(zhì)的抑菌活性，并用雙面刀片從抑菌物質(zhì)作用產(chǎn)生的透明圈的邊際取樣(3～5 mm3)，2.5%戊二醛固定2 h，磷酸緩沖液清洗，酒精梯度脫水(體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、90%、100%乙醇各20 min)，干燥，離子鍍膜法鍍膜，掃描電鏡觀察、照相。以未受到抑制作用的菌絲作為對照。

1.5 抑菌物質(zhì)對菌絲細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組成物質(zhì)影響的檢測

1.5.1抑菌物質(zhì)對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組成物質(zhì)的拮抗作用測試

參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行，配制含有不同濃度的膠狀幾丁質(zhì)、殼聚糖、β-1，3葡聚糖的培養(yǎng)基，其終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、10.0 mg/mL，滅菌備用。卵磷脂、麥角甾醇、膽固醇分別配成質(zhì)量濃度l mg/mL母液，過濾除菌后，加入培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、10.0、50.0 μg/mL。通過牛津杯法檢測加入的物質(zhì)是否對抑菌物質(zhì)的抑菌活性產(chǎn)生拮抗作用。

1.5.2抑菌物質(zhì)對菌絲細(xì)胞膜中麥角甾醇合成的檢測

1.5.2.1 菌株培養(yǎng)及難皂化脂的提取[19-20]

將抑菌物質(zhì)加入到PDB培養(yǎng)液中，終質(zhì)量濃度為10.21 μg/mL，同時接入串珠鐮刀菌孢子懸浮液。以不加抑菌物質(zhì)作為空白對照組，培養(yǎng)3 d后，分別離心收集菌體，PBS洗滌兩次至上清液無色，去上清液。精確稱取菌體2.5 g，置于250 mL回流瓶中，加堿醇溶液(20% NaOH與95%乙醇體積比為5∶3)32 mL，在90 ℃水浴中皂化1.5 h。再加95%乙醇4 mL繼續(xù)皂化1 h，冷卻后加20 mL 石油醚(沸程30～60 ℃)，充分振蕩20 min，靜置2 h。提取2次，取上層液，用10 mL蒸餾水洗1次，取1 mL定容至10 mL，備用。

1.5.2.2 麥角甾醇HPLC檢測[21]

色譜條件為: 流動相V(甲醇)∶V(水)為98∶2；柱溫30 ℃，檢測波長280 nm，流速1.0 mL/min，靈敏度0.01 AUFS，進(jìn)樣量10 μL。

配制麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1 .000 0 mg/mL，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性物質(zhì)的抑菌作用分析

Streptomycesalboflavus中活性物質(zhì)對串珠鐮刀菌的抑制作用見圖1。由圖1可知，加入活性物質(zhì)的牛津杯周圍產(chǎn)生透明的抑菌圈，活性物質(zhì)顯示出很強(qiáng)的抑菌作用，在透明圈內(nèi)沒有串珠鐮刀菌生長。

圖1 抑菌物質(zhì)對串珠鐮刀菌的抑制作用Fig.1 Inhibit action of active antifungal substance against Fusarium moniliforme

2.2 pH紙層析結(jié)果

抑菌物質(zhì)pH紙層析結(jié)果見圖2(層析體系為50%乙醇)。由圖2可以看出，該物質(zhì)呈現(xiàn)中性抗生素的特征，不論pH值有何變化，Rf值幾乎不變。

以不同pH值緩沖液處理的層析紙為固定相，用合適的溶劑系統(tǒng)為移動相，對不同類型的抗生素進(jìn)行層析，pH紙層析的Rf值有一定變化規(guī)律?？蓪⒖股胤譃樗嵝钥股亍A性抗生素、中性抗生素和兩性抗生素。

圖4 抑菌物質(zhì)對菌絲形態(tài)影響的光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果Fig.4 Effects of antifungal substance on morphological of Fusarium moniliforme by optical microscope

圖2 抑菌物質(zhì)的pH紙層析結(jié)果Fig.2 Results of paper chromatography of pH system

2.3 捷克八溶劑紙層析結(jié)果

抑菌物質(zhì)捷克八紙層析結(jié)果見圖3。由圖3可知，活性物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)5和6中移動極小，而在其他溶劑系統(tǒng)中均移動較大，成為倒船帆形。與捷克學(xué)者提出的6類標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，所得的活性物質(zhì)的抗生素類別與非水溶性Ⅰ型抗生素層析圖譜相似，推斷該活性物質(zhì)為非水溶性Ⅰ型抗生素。

圖3 抑菌物質(zhì)在捷克八溶劑系統(tǒng)的紙層析結(jié)果Fig.3 Results of paper chromatography of Doskochilova system

2.4 抑菌物質(zhì)對菌絲形態(tài)的影響

2.4.1光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果

用光學(xué)顯微鏡觀察抑菌物質(zhì)對菌絲體形態(tài)的影響，結(jié)果如圖4。由圖4可知，空白對照組，菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、表面光滑，菌絲體圓潤飽滿、分布均勻，表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)；抑菌物質(zhì)作用48 h后的串珠鐮刀菌菌絲生長畸形，變得粗細(xì)不均，尤其菌絲末端有膨大現(xiàn)象，整個菌絲上有“念珠狀”空泡出現(xiàn)，并可見不完整菌絲，原生質(zhì)體外泄。實驗結(jié)果表明，抑菌物質(zhì)可能會通過使菌絲末端膨大阻礙菌絲繼續(xù)生長。

2.4.2熒光顯微鏡觀察結(jié)果

經(jīng)PI染色后的空白對照組和抑菌物質(zhì)處理組菌絲，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果如圖5。圖5中，抑菌物質(zhì)處理15 min后，多數(shù)菌絲的細(xì)胞核被染成了紅色，而空白對照組菌絲沒有被染色，推測抑菌物可能破壞串珠鐮刀菌菌絲細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜通透性改變，干擾了菌體正常生理代謝的功能，從而起到對串珠鐮刀菌的抑制作用。

2.4.3掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察抑菌物質(zhì)對串珠鐮刀菌的抑制作用，結(jié)果見圖6。圖6中，空白對照組菌絲生長繁茂，菌絲細(xì)長、均勻；活性物質(zhì)處理組，大多數(shù)菌絲體變形、孢子萌發(fā)出畸形的菌芽，出現(xiàn)較大的囊泡。泡囊狀菌絲表面凹凸不平，并殘留有碎片，推測活性物質(zhì)可能會抑制孢子的萌發(fā)，破壞串珠鐮刀菌菌體的完整性，進(jìn)而產(chǎn)生抑菌或殺菌作用。

2.5 抑菌物質(zhì)對菌絲細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組成物質(zhì)的影響

2.5.1抑菌物質(zhì)對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組成物質(zhì)的拮抗效果

抑菌物質(zhì)對細(xì)胞壁物質(zhì)和細(xì)胞膜組成物質(zhì)的拮抗作用見圖7。圖7中，含有膠狀幾丁質(zhì)、殼聚糖、β-1，3葡聚糖、卵磷脂和膽固醇的培養(yǎng)皿中活性組分的抑菌作用沒有變化；而含有麥角甾醇的平板中，抑菌物質(zhì)的抑菌圈直徑減小，并隨著麥角甾醇濃度的增加，拮抗效果加強(qiáng)，提示抑菌物質(zhì)對串珠鐮刀菌的作用靶點可能與細(xì)胞膜中麥角甾醇有關(guān)。

1～6分別表示：膠狀幾丁質(zhì)、殼聚糖、β-1，3葡聚糖、卵磷脂、麥角甾醇、膽固醇；不同小寫字母表示經(jīng)Duncan 新復(fù)極差法檢驗，在P<0.05水平差異顯著。圖7 細(xì)胞膜壁物質(zhì)對抑菌物質(zhì)的拮抗效果Fig.7 Antagonism of components of cell membrane and cell wall to antifungal substance

2.5.2抑菌物質(zhì)對菌絲細(xì)胞膜中麥角甾醇合成的影響

2.5.2.1 麥角甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

對不同質(zhì)量濃度的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行HPLC分析。以麥角甾醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，麥角甾醇質(zhì)量濃度為0.062 5～1.000 0 mg/mL時，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，回歸方程為Y=6 378.8X+87.864，R2=0.999 9。

2.5.2.2 串珠鐮刀菌菌體細(xì)胞膜中麥角甾醇的檢測結(jié)果

以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和峰面積值分別作為定性、定量依據(jù)。結(jié)果表明，正常菌絲的細(xì)胞膜中麥角甾醇質(zhì)量濃度為124.00 ng/mL，而用抑菌物質(zhì)處理菌絲的細(xì)胞膜中麥角甾醇的質(zhì)量濃度為0.81 ng/mL，表明抑菌物質(zhì)處理后的串珠鐮刀菌菌絲細(xì)胞膜中麥角甾醇的生物合成減小。

3 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明，Streptomycesalboflavus產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對串珠鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)都有很強(qiáng)的抑制作用。抗菌物質(zhì)濃度高時，能造成菌絲生長畸形、短粗，膨大形成“念珠狀”，菌絲不能向前生長，從而使其受到抑制；此外，抗菌物質(zhì)處理后的病原菌菌絲尖端形成膨脹泡而破裂，引起原生質(zhì)外泄，造成溶菌現(xiàn)象。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，活性物質(zhì)還可能對串珠鐮刀菌的菌體細(xì)胞膜造成損傷，導(dǎo)致大分子的PI染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞核DNA結(jié)合生成紅色熒光物，而正常組菌絲中未見紅色熒光物。通過檢測細(xì)胞壁物質(zhì)和細(xì)胞膜組成物質(zhì)與抑菌物質(zhì)對串珠鐮刀菌抑菌效果的拮抗作用的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基含有麥角甾醇的平皿中，抑菌物質(zhì)的抑菌圈直徑減??；進(jìn)一步用HPLC法檢測了經(jīng)過抑菌物質(zhì)處理的菌絲和空白對照組菌絲中難皂化脂類提取物中麥角甾醇的含量，結(jié)果表明，受抑菌物質(zhì)作用的菌絲細(xì)胞膜中麥角甾醇的生物合成減少。

鏈霉菌是重要的天然抗生素來源菌群，自從抗生素問世以來，各國學(xué)者對抗生素如何作用于微生物和作用的具體靶標(biāo)位點等抑菌機(jī)理進(jìn)行了很多研究。結(jié)果表明，抗生素能通過作用于微生物細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，抑制核酸或核苷酸的合成等多種方式產(chǎn)生抑菌效果；而有一些抗菌物質(zhì)會通過幾種抑制方式同時作用于病原菌，達(dá)到抑菌作用。Streptomycesalboflavus產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對指示菌蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)、核酸或核苷酸的合成等其他作用方式值得進(jìn)一步探究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在抑菌機(jī)理方面的應(yīng)用，也有報道發(fā)現(xiàn)一些新的特異性作用靶點和專化性靶標(biāo)酶[22-23]。研究抑菌物質(zhì)的抑菌機(jī)理及新的抑菌作用方式對探尋新型防霉保鮮劑具有重要意義。