腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特征及Transwell共培養(yǎng)對胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的影響

邵久針，王穎鈺，印 鑫，許尤琪，沈明勤

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥藥理毒理實(shí)驗室,江蘇 南京 210028;2. 江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥藥理毒理實(shí)驗室,江蘇 南京 210028;3. 江蘇省第二中醫(yī)院腫瘤科,江蘇 南京 210008)

胃癌是常見的惡性腫瘤，位于全球發(fā)病率第5位、死亡率第3位，而我國屬胃癌高發(fā)國家，發(fā)病與死亡例數(shù)約占世界的50%，是癌癥防治的重點(diǎn)[1]。癌癥的演化過程中，腫瘤細(xì)胞會積極募集成纖維細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞，營造低氧高酸性的腫瘤微環(huán)境，對腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。在胃腸道腫瘤中，基質(zhì)細(xì)胞占腫瘤質(zhì)量的50%以上，與胃正常成纖維細(xì)胞(normal fibroblasts，NFs)相比，胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)作為存在于腫瘤間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞亞群，是腫瘤微環(huán)境中重要的基質(zhì)細(xì)胞[3]，可通過分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGFβ)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)等細(xì)胞因子，重塑細(xì)胞外基質(zhì)[4]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，并增強(qiáng)腫瘤的耐藥性。

目前，研究偏向以傳統(tǒng)的單細(xì)胞培養(yǎng)或接觸式共培養(yǎng)模式，探究CAFs促癌增殖和轉(zhuǎn)移作用，而基于Transwell共培養(yǎng)體系探究CAFs與NFs對不同比例胃癌細(xì)胞影響的報道較少。本研究在分離鑒定原代人CAFs、NFs細(xì)胞及形態(tài)學(xué)特征的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建CAFs/NFs-胃癌細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)模型，探究成纖維細(xì)胞對不同比例胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及初步機(jī)制，既達(dá)到成纖維細(xì)胞與胃癌細(xì)胞非接觸式生長，又保證了細(xì)胞間正常信號傳導(dǎo)及相互影響，更接近于人體腫瘤微環(huán)境，為研究基于腫瘤微環(huán)境CAFs、NFs對胃癌細(xì)胞的影響提供研究思路、方法與參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞與試劑人胃癌細(xì)胞MGC-803(貨號:HXC-0136)，購自南京宏新。胎牛血清(Gibco);DMEM不完全高糖培養(yǎng)液(江蘇凱基); CXCR4拮抗劑AMD3100(APExBIO);DAPI、BSA(Sigma);全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天);TRIzol(Invitrogen); cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green Master Mix (諾唯贊);Matrigel基底膠(BD);活性氧(reactive oxygen species，ROS)測定試劑盒、乳酸測定試劑盒(南京建成); α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(BM0002)、β-actin(BM0627)抗體，均購自博士德; 波形蛋白(Vimentin)抗體(ab92547)、羊抗兔二抗(ab6721)，均購自Abcam;羊抗鼠二抗(A21010-1)、Dylight488羊抗兔IgG(A23220)，購自Abbkine；Transwell 24孔板(Corning,costar3422聚碳脂膜, 膜直徑6.5 mm，孔徑8.0 μm);Transwell 6孔板(Corning,costar3412聚碳脂膜, 膜直徑24 mm，孔徑0.4 μm)。

1.2 儀器Heracell 150i二氧化碳培養(yǎng)箱、NanoDrop one紫外分光光度計、TCA5020普通PCR儀、ABI 7500熒光定量PCR循環(huán)儀、Varioskan flash全波長多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher);PowerPac Basic電泳儀(Bio-Rad);Primo Vert倒置顯微鏡、Axioskop 2 plus熒光顯微鏡(ZEISS); Spectrumlab 752s紫外可見分光光度計(上海棱光)。

2 方法

2.1 CAFs、NFs的分離純化及傳代培養(yǎng)收集于江蘇省第二中醫(yī)院腫瘤科接受胃癌手術(shù)切除治療患者的胃癌組織和配對癌旁組織標(biāo)本，于冰上用含雙抗的PBS清洗，棄上皮和脂肪組織，剪至1 mm3組織塊，加入少量含20%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置孵育，4～5 d換液后，每隔48 h換液。待細(xì)胞長滿后，以10%胎牛血清培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)，取第3～9代成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。本研究獲得江蘇省第二中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，編號為201609001。

2.2 CAFs、NFs的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察CAFs、NFs從組織塊分離純化情況，常規(guī)傳代培養(yǎng)，記錄其生長狀況和形態(tài)學(xué)特征。

2.2.2免疫熒光法檢測α-SMA、Vimentin 取對數(shù)生長期的CAFs、NFs，加入含蓋玻片的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100溶液通透20 min，1% BSA封閉30 min。分別加入一抗α-SMA和Vimentin孵育過夜，二抗Dylight488孵育30 min，DAPI染核5 min，于熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

2.2.3qPCR檢測α-SMA、Vimentin TRIzol法提取CAFs、NFs總RNA，經(jīng)濃度、純度測定符合要求后，用cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以α-SMA、Vimentin基因上、下游引物擴(kuò)增，并進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參照，在凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行PCR結(jié)果分析。2-ΔΔCT法計算α-SMA、Vimentin基因的相對表達(dá)量。引物序列如下:GAPDH,5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′(forward primer),5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3′(reverse primer);α-SMA,5′-TATCCCCGGGACTAAGACGG-3′(forward primer),5′-CACCATCACCCCCTGATGTC-3′(reverse primer);Vimentin,5′-CGGGAGAAATTGCAGGAGGA-3′(forward primer),5′-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3′(reverse primer)。

2.2.4Western blot檢測α-SMA、Vimentin 取對數(shù)生長期的CAFs、NFs裂解30 min，離心取上清液。BCA法測定蛋白含量，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，以α-SMA、Vimentin為一抗，β-actin為內(nèi)參，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，加入ECL曝光顯色。

2.3 MTT法繪制CAFs、NFs的生長曲線取對數(shù)生長期的CAFs、NFs，以每孔4×103個接種至96孔板，設(shè)6個復(fù)孔及空白組，依次在培養(yǎng)0、1、2、3 d后，加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加入150 μL DMSO溶液后，振蕩10 min，于波長492 nm下測定各孔吸光度值，并繪制生長曲線。

2.4 成纖維細(xì)胞對不同比例胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響

2.4.1構(gòu)建CAFs/NFs-腫瘤細(xì)胞Transwell懸掛式非接觸共培養(yǎng)體系 取CAFs、NFs，以每孔1.6×105個種植于Transwell 6孔板，24 h達(dá)到對數(shù)生長期后，調(diào)整MGC-803細(xì)胞密度分別為低密度1.2×108·L-1(L組)、中密度2.4×108·L-1(M組)、高密度4.8×108·L-1(H組)，每孔1.5 mL種植于Transwell小室共培養(yǎng)48 h，在確保共培養(yǎng)體系細(xì)胞高產(chǎn)出率的同時，又可體現(xiàn)不同比例共培養(yǎng)體系的差異性。同時設(shè)置上層為MGC-803細(xì)胞，下層為基礎(chǔ)培養(yǎng)液的空白對照(C組)。

2.4.2MTT法檢測細(xì)胞增殖活力 分別取CAFs、NFs共培養(yǎng)L、M、H組MGC-803細(xì)胞，以每孔4×103個接種于96孔板，設(shè)5個復(fù)孔及空白組，于0、1、2、3、4、5 d后進(jìn)行MTT實(shí)驗，繪制細(xì)胞生長曲線。分別取48、72 h處吸光度值進(jìn)行顯著性檢驗，分析共培養(yǎng)體系對胃癌細(xì)胞增殖活力的影響。

2.4.3Transwell法檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力 細(xì)胞遷移實(shí)驗中，取CAFs以每孔3.6×104個種植于Transwell 24孔板，設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，取CAFs共培養(yǎng)L、M、H組的MGC-803細(xì)胞，以每孔6×104個種植于Transwell小室共培養(yǎng)48 h。預(yù)冷甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色并拍照。NFs共培養(yǎng)組同上。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗中，以1 ∶8稀釋Matrigel基質(zhì)膠，膠凝后，CAFs以每孔3.6×104個種植于24孔板，設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，取CAFs共培養(yǎng)L、M、H組的MGC-803細(xì)胞，以每孔1.2×105個種植于Transwell小室共培養(yǎng)48 h。預(yù)冷甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色并拍照。NFs共培養(yǎng)組同上。

2.5 AMD3100對CAFs-胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系的影響取CAFs以每孔1.6×105個種植于Transwell 6孔板，24 h后調(diào)整MGC-803細(xì)胞密度分別為L組、M組、H組，以每孔1.5 mL種植于Transwell小室共培養(yǎng)24 h后，加入AMD3100(10 mg·L-1)至小室繼續(xù)刺激24 h，并設(shè)置空白對照(C組)。分別取上述MGC-803細(xì)胞，以每孔4×103個接種于96孔板，設(shè)5個復(fù)孔及空白組，分別培養(yǎng)48、72 h后，MTT法測定各孔吸光度值。

2.6 成纖維細(xì)胞對不同比例胃癌細(xì)胞影響的初步機(jī)制

2.6.1pH計測定腫瘤微環(huán)境酸化情況 取CAFs以每孔1.6×105個種植于Transwell 6孔板，24 h后調(diào)整MGC-803細(xì)胞密度分別為L組、M組、H組，以每孔1.5 mL種植于Transwell小室共培養(yǎng)，分別于24、48 h取共培養(yǎng)體系上清液測定pH值。

2.6.2乳酸酶法檢測細(xì)胞分泌乳酸情況 分別取上述共培養(yǎng)體系24、48 h細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清液，根據(jù)試劑盒說明操作，于530 nm處測定吸光度值，并計算乳酸含量。

2.6.3DCFH-DA法檢測CAFs中ROS水平 取上述共培養(yǎng)后CAFs，根據(jù)試劑盒說明操作，以10 μmol·L-1DCFH-DA孵育30 min，于激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm處測定吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 CAFs、NFs的分離純化組織塊接種7 d后，可見CAFs、NFs逐漸沿組織塊邊緣呈放射狀生長，形態(tài)呈長梭形、扁平星形、多角形等，CAFs細(xì)胞生長速度較快，14 d左右狀態(tài)良好，NFs生長速度較慢，21 d左右狀態(tài)良好。細(xì)胞消化傳代后移入培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至第3代時得到純化的成纖維樣細(xì)胞，鏡檢未見上皮樣細(xì)胞。

3.2 CAFs、NFs的鑒定

3.2.1形態(tài)學(xué)特征 如Fig 1所示，CAFs、NFs形態(tài)、大小無明顯差異，通常含1～3個核，呈梭形、多角形、不規(guī)則形等，可隨細(xì)胞間連接方式的變化而改變。相比NFs，CAFs生長速度較快，重疊生長現(xiàn)象更明顯。CAFs、NFs在3～6代時活力旺盛，形態(tài)呈梭形，7代以后逐漸出現(xiàn)胞體偏肥大現(xiàn)象，但繼續(xù)培養(yǎng)，胞體變小，呈長梭形緊密排列，細(xì)胞群呈柵欄狀、放射狀、旋渦狀等。17、18代時，細(xì)胞活力減弱，不易呈梭形，并出現(xiàn)胞體肥大、光亮度下降、大量顆粒物質(zhì)、空泡等老化現(xiàn)象。

Fig 1 Isolation, purification and overlapping growth of human CAFs, NFs cells(×100)

A: CAFs and NFs cells grew radially along the margin of tissue mass; B: CAFs and NFs cells(the fourth generation) were vigorous and mostly in the shape of long spindle; C: Both CAFs and NFs cells appeared overlapping growth phenomenon(circled in red box), but the phenomenon of CAFs cells was more obvious.

3.2.2α-SMA、Vimentin的表達(dá) 如Fig 2A、B、C所示，通過免疫熒光法、qPCR、Western blot測定，CAFs高表達(dá)α-SMA和Vimentin，而NFs呈低表達(dá)或陰性(P<0.01)。經(jīng)鑒定，CAFs高表達(dá)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞激活標(biāo)志物α-SMA和成纖維細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin，NFs保留了Vimentin的表達(dá)，分離純化成功，原代培養(yǎng)細(xì)胞為人胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)和正常成纖維細(xì)胞(NFs)，為后期研究提供可靠的細(xì)胞模型。

3.3 CAFs、NFs的生長曲線如Fig 2D所示，分離純化的CAFs、NFs生長狀態(tài)良好，純化和培養(yǎng)條件較為適合，CAFs增殖能力和細(xì)胞活性均強(qiáng)于NFs。

3.4 成纖維細(xì)胞對不同比例胃癌細(xì)胞的影響如Fig 3所示，CAFs共培養(yǎng)組MGC-803細(xì)胞活力L組>M組>H組，NFs共培養(yǎng)組L、M組相近>H組，僅有CAFs低密度共培養(yǎng)組MGC-803細(xì)胞活力明顯高于未共培養(yǎng)組，遷移、侵襲結(jié)果與48 h處吸光度結(jié)果保持一致。表明胃癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞CAFs、NFs共培養(yǎng)受比例影響較大，在一定空間內(nèi)，隨胃癌細(xì)胞比重的增加，共培養(yǎng)體系可能會反過來抑制腫瘤細(xì)胞的增長和轉(zhuǎn)移。同時，空白對照組、L、M、H組的MGC-803細(xì)胞吸光度值差異無顯著性，證明此共培養(yǎng)體系選用的接種密度不影響胃癌細(xì)胞活性。

Fig 3 Proliferation, migration and invasion of co-cultured MGC-803 cells(×100)

CAFs共培養(yǎng)組促癌增長與轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)于NFs組，腫瘤細(xì)胞離開共培養(yǎng)體系后，CAFs促癌增殖能力逐漸減弱，趨向于未共培養(yǎng)組，如Fig 3C所示(72 h)。但NFs在一定程度上也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，可能與腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)NFs分化為CAFs的過程及成纖維細(xì)胞的高度異質(zhì)性有關(guān)。

3.5 AMD3100對CAFs-胃癌細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)體系的影響如Fig 3C所示，AMD3100-CAFs-胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)組與常規(guī)CAFs-胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)組吸光度值差異均有顯著性。在低密度組、空白組共培養(yǎng)體系中，AMD3100均可抑制胃癌細(xì)胞的增長，離開共培養(yǎng)體系后，其抑癌增殖能力逐漸減弱。但隨著胃癌細(xì)胞比重增加，AMD3100可能會減弱CAFs高密度共培養(yǎng)體系的抑癌效果。

3.6 CAFs-胃癌細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)體系酸化情況如Fig 4A所示，與空白組相比，CAFs共培養(yǎng)體系pH值降低，表明CAFs為胃癌營造出“高酸性”的腫瘤微環(huán)境，并隨共培養(yǎng)時間延長而酸性增強(qiáng)。其中，高密度共培養(yǎng)組CAFs層pH值明顯低于低、中密度共培養(yǎng)組，而胃癌層并無明顯現(xiàn)象。

3.7 CAFs-胃癌細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)體系乳酸及ROS含量如Fig 4B、4C所示，在共培養(yǎng)體系胃癌層中，低密度共培養(yǎng)組乳酸含量低于空白組，而高密度共培養(yǎng)組高于空白組，并隨共培養(yǎng)時間延長乳酸含量降低。在共培養(yǎng)體系CAFs層，乳酸、ROS含量均高于空白組，且隨著胃癌密度增大而增加。

4 討論

腫瘤異質(zhì)性是惡性腫瘤的特征之一，可使腫瘤的生長轉(zhuǎn)移、藥物敏感性、預(yù)后等方面產(chǎn)生差異[5]，主要體現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞本身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、行為差異性，以及微環(huán)境隨腫瘤發(fā)展的動態(tài)變化。研究顯示，CAFs和NFs不僅可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，也可抑制腫瘤的生長[6-7]，同時NFs也可表達(dá)α-SMA等癌相關(guān)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物[8]，推翻了以往對成纖維細(xì)胞的認(rèn)知，但具體發(fā)生機(jī)制尚未闡明。AMD3100是CXCR4的特異性小分子拮抗劑，普遍認(rèn)為通過阻斷SDF-1/CXCR4等信號通路，抑制胃癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移[9]。但2018年Berning等[10]發(fā)現(xiàn)，AMD3100可促進(jìn)尤文肉瘤細(xì)胞的增殖，并激活受體酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)，但目前胃癌研究中尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。CAFs在形態(tài)、來源和功能等方面均體現(xiàn)出高度異質(zhì)性，近幾年來，此異質(zhì)性作用逐漸得到國外學(xué)者重視，然而國內(nèi)報道寥寥無幾，值得進(jìn)一步關(guān)注。

本實(shí)驗通過對人CAFs、NFs的生物學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CAFs、NFs的形態(tài)、大小無明顯差異，可能與CAFs來源于靜息狀態(tài)成纖維細(xì)胞(NFs)有關(guān)。篩選出較為適宜探究CAFs促癌功效的共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)CAFs、NFs對腫瘤細(xì)胞的促進(jìn)和抑制作用受共培養(yǎng)比例影響較大，低密度CAFs-腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系更能明顯提高胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，高密度共培養(yǎng)體系可能會抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并通過3種不同比例共培養(yǎng)，最大程度表現(xiàn)出腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性效果。首次發(fā)現(xiàn)CAFs-AMD3100可明顯抑制低密度胃癌細(xì)胞活性，而促進(jìn)中高密度胃癌細(xì)胞增長，表明腫瘤異質(zhì)性在CAFs細(xì)胞及其SDF-1/CXCR4通路均有體現(xiàn)，為后期探究腫瘤微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的促進(jìn)或抑制作用、AMD3100對腫瘤胞的異質(zhì)性影響提供實(shí)驗參考與思路。

Pavlides等[11]提出一種新的能量傳遞機(jī)制“反Warburg效應(yīng)”，即腫瘤細(xì)胞分泌過氧化氫，有針對性觸發(fā)CAFs的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致CAFs線粒體吞噬，產(chǎn)生更多ROS，誘發(fā)連鎖反應(yīng)，并通過糖酵解方式產(chǎn)生乳酸、酮等高能量線粒體原料[12]，促進(jìn)癌細(xì)胞獲得混合糖酵解/OXPHOS表型，以提高代謝可塑性并提供能量[13]。研究發(fā)現(xiàn)，胃腸道腫瘤患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，少量ROS可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，但過高濃度ROS可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗通過不同比例共培養(yǎng)刺激CAFs的“反Warburg效應(yīng)”，發(fā)現(xiàn)低密度共培養(yǎng)組分泌少量的乳酸和ROS，并具有促癌效果，而高密度共培養(yǎng)組酸度過低，乳酸、ROS過高可能與抑制腫瘤細(xì)胞活力有關(guān)。此模型的建立，有助于利用腫瘤微環(huán)境的正反Warburg效應(yīng)，對腫瘤代謝依賴性和耐藥性作用機(jī)制進(jìn)行深入探究。

腫瘤生長轉(zhuǎn)移是一個多因素、多步驟的協(xié)同演變過程，受腫瘤微環(huán)境及眾多細(xì)胞因子相互影響，具體機(jī)制尚未明確。CAFs可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，且基因組相對穩(wěn)定，不易耐藥。積極探索CAFs與NFs差異性及與腫瘤細(xì)胞的相互作用，對從腫瘤微環(huán)境多方向、多靶點(diǎn)治療胃癌有重要意義，為腫瘤的綜合治療和抗腫瘤轉(zhuǎn)移提供了實(shí)驗依據(jù)，也為多組份、多靶點(diǎn)的中醫(yī)藥防治腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移提供了可能和新的研究方向。

(致謝:本實(shí)驗在江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥藥理毒理實(shí)驗室完成，非常感謝本課題組全體老師和同學(xué)的指導(dǎo)和幫助。)