纖維素降解菌的分離及發(fā)酵液對(duì)大豆種子萌發(fā)的影響

孫光壯 朱栗緯 王亞 崔瑩瑩 喻文新 孫冬梅 林志偉 肖翠紅

摘要：為提高秸稈還田過(guò)程中的腐解效率，采用CMC-Na培養(yǎng)基、剛果紅和濾紙平板培養(yǎng)基分離出1株纖維素降解能力強(qiáng)的放線菌菌株，同時(shí)利用種子萌發(fā)法研究該菌對(duì)大豆[Glycine max （Linn.） Merr.]種子的促生作用，并分析了纖維素降解菌發(fā)酵液對(duì)大豆種子過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量的影響。結(jié)果表明，分離出的菌株具有較強(qiáng)的分解纖維素能力，而且不同濃度的發(fā)酵液對(duì)大豆種子的萌發(fā)率和抗氧化酶活性均有影響。當(dāng)發(fā)酵液濃度為100.0%時(shí)，大豆種子的萌發(fā)率達(dá)到最高值，為74.53%，與對(duì)照（不加菌液的Mendals培養(yǎng)基）相比提高了21.96個(gè)百分點(diǎn);大豆種子CAT和SOD活性最強(qiáng)，與對(duì)照相比分別提高了291.45%和106.64%;POD活性為25.6 U/（mL·min），比對(duì)照提高了101.96%，但與純水培養(yǎng)相比下降了14.65%。MDA含量在發(fā)酵液濃度為16.7%時(shí)最低，與對(duì)照相比降低了21.37%。初步證實(shí)了纖維素降解菌發(fā)酵液中含有能促進(jìn)大豆種子萌發(fā)和抗氧化酶活性升高的物質(zhì)，以及保護(hù)膜組分的物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：纖維素降解菌;大豆[Glycine max （Linn.） Merr.];種子萌發(fā)

中圖分類號(hào)：Q936;S565.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）17-0016-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.004? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： In order to improve the decomposition efficiency of straw returning to the field， an actinomycete strain with strong cellulose degradability was isolated by using CMC-Na medium， Congo red medium and filter paper plate medium. At the same time， the seed germination method was used to study the growth-promoting effect of the strain on soybean [Glycine max （Linn.） Merr.] seeds. The activities of POD， CAT and SOD? and the content of MDA in soybean seeds were also studied. The results showed that the isolated strain had a strong ability to decompose cellulose， and the germination rate and antioxidant enzyme activity of soybean seeds were changed after treated with different concentrations of cellulose-degrading bacteria fermentation broth. When the concentration of fermentation broth was 100.0%， the germination rate of soybean seeds reached the highest， was 74.53%， increasing by 21.96 percent compared with the control（Mendal's medium without bacterial fluid）; the activity of CAT and SOD was the strongest， which increased by 291.45% and 106.64% respectively compared with the control; and the POD activity was 25.6 U/（mL·min）， 101.96% higher than that of the control， but it was 14.65% lower than that of the pure water culture. The content of MDA was the lowest at 16.7%， which was 21.37% lower than that of control. It was preliminarily confirmed that the fermentation broth of cellulose-degrading bacteria contained substances which could promote the germination of soybean seeds and increase the activities of antioxidant enzymes， as well as protective membrane components.

Key words： cellulose-degrading actinomycetes; soybean[Glycine max （Linn.） Merr.]; seed germination

大豆[Glycine max （Linn.） Merr.]是中國(guó)主要的糧食作物之一，年產(chǎn)量約1 500萬(wàn)t，每年在大面積種植帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)廢棄物——大豆秸稈，其產(chǎn)生量約2 500萬(wàn)t/年[1，2]。大豆秸稈中富含大量纖維素類物質(zhì)、氮、磷、鉀、粗蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分和許多微量元素[3]，其中纖維素類物質(zhì)是限制其快速降解的因素之一。

纖維素是自然界中分布最廣、儲(chǔ)量最多的碳水化合物，是植物細(xì)胞壁的主要成分，是一種可持續(xù)的能源物質(zhì)，同時(shí)也是尚未得到充分利用的一類可再生資源[4，5]。但是纖維素在降解過(guò)程中存在周期長(zhǎng)、降解困難等問(wèn)題[6]。為了處理難以降解的秸稈廢棄物，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中多以焚燒的方式進(jìn)行處理，從而造成大量能源浪費(fèi)，同時(shí)伴有嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題。因此，尋找一種高效、節(jié)能環(huán)保的處理秸稈的方法勢(shì)在必行。

目前，利用微生物處理秸稈是研究的重點(diǎn)。它具有纖維素分解效率高、無(wú)污染的特點(diǎn)。自然界中存在大量能夠產(chǎn)生纖維素酶的微生物，這類微生物資源經(jīng)分離篩選和馴化后一般具有對(duì)人畜無(wú)害、生物轉(zhuǎn)化效率高、作用條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，因而具有很大的應(yīng)用潛力，尤其在生物質(zhì)固體廢棄物資源化方面更具有廣闊的應(yīng)用前景[7，8]。但是利用微生物處理秸稈的關(guān)鍵問(wèn)題是如何高效地解決纖維素降解問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)用于分解纖維素的微生物大多是真菌，尤其是以木霉屬（Trichoderma）和曲霉屬（Aspergillus）為主，但在放線菌屬中也不乏存在一些高效的菌株。

超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）是植物活性氧清除系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，它們能有效地阻止高濃度氧的快速積累，防止膜脂的過(guò)氧化作用，延緩植物的衰老，增強(qiáng)植物抗逆性[9]。丙二醛（MDA）是常用的膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。本試驗(yàn)通過(guò)使用選擇培養(yǎng)分離的方法，獲得了1株高效纖維素降解菌，通過(guò)研究該菌株不同發(fā)酵液對(duì)大豆種子的促生作用及抗氧化酶活性試驗(yàn)，以期為大豆秸稈降解還田后對(duì)作物生長(zhǎng)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

供試大豆品種為綏農(nóng)29，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基：①赫奇遜分離培養(yǎng)基。KH2PO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO3 2.5 g，F(xiàn)eCl3 0.001 g，CaCl2 0.1 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。②剛果紅篩選培養(yǎng)基。K2HPO4 0.50 g，MgSO4 0.25 g，纖維素粉1.88 g，剛果紅0.20 g，瓊脂20 g，加去離子水至800 mL，調(diào)整pH為7.0，補(bǔ)充到1 000 mL，用于纖維素降解菌的復(fù)篩。③高氏1號(hào)培養(yǎng)基?？扇苄缘矸?0 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂20 g，去離子水定容至1 000 L，pH為7.4～7.6，121 ℃滅菌30 min后，用于纖維素降解菌的活化。④Mendals培養(yǎng)基。KH2PO4 2.0 g，（NH4）2SO4 1.4 g，尿素 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，纖維素粉或?yàn)V紙漿 5.0 g，去離子水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌30 min后，用于纖維素降解菌的液體培養(yǎng)。

1.2? 方法

1.2.1? 菌種的分離及初步鑒定? 稱取長(zhǎng)期堆腐土壤樣品10 g，置于盛有90 mL無(wú)菌水的（加玻璃珠）三角瓶中，振蕩20 min制成菌懸液，依次稀釋成梯度為10-1、10-2、10-3不同濃度。然后將赫奇遜培養(yǎng)基冷卻后倒皿，鋪上滅過(guò)菌的新華濾紙，將不同濃度的土壤菌懸液在濾紙平板上點(diǎn)樣，每個(gè)平板5～6個(gè)點(diǎn)，37 ℃培養(yǎng)5 d后，將生長(zhǎng)出的放線菌菌株點(diǎn)接于剛果紅平板復(fù)篩，37 ℃培養(yǎng)，選出水解圈大的單菌落保存。

供試菌株在高氏1號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行活化，37 ℃培養(yǎng)4 d后，進(jìn)行插片法觀察菌體的形態(tài)特征并拍照。

1.2.2? 纖維素降解菌發(fā)酵液的制備? 將纖維素降解菌接種到高氏1號(hào)斜面培養(yǎng)基上活化5 d，加入無(wú)菌水10 mL，用接種環(huán)將纖維素降解菌菌落刮下，制成濃度為（1.0±0.2）×107 CFU/mL的懸液。在裝有200 mL Mendals培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中加入菌體懸液3 mL，28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)10～15 d，濾紙過(guò)濾后，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌得到無(wú)菌濾液。4 ℃保存?zhèn)溆茫?次重復(fù)。將無(wú)菌濾液和無(wú)菌水配制成不同濃度的發(fā)酵液，分別為0、16.7%、33.3%、50.0%、66.7%和100.0%，共6個(gè)處理，以不加菌液的Mendals培養(yǎng)基為對(duì)照，記為CK。選取飽滿、大小均勻的大豆種子，用去離子水沖洗種子表面，然后用0.1%的升汞殺菌8 min，無(wú)菌水沖洗3次，均勻擺放在鋪有3層濾紙并加有5 mL無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中，每皿50粒。向每個(gè)皿中均勻噴灑對(duì)應(yīng)濃度的處理液10 mL，每處理3次重復(fù)，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)。從處理的第二天開(kāi)始，每天同一時(shí)間記錄各個(gè)培養(yǎng)皿中萌發(fā)的種子數(shù)，每天同一時(shí)間補(bǔ)充10 mL發(fā)酵液。發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為胚根伸出種臍部分長(zhǎng)度超過(guò)種子縱徑一半為標(biāo)準(zhǔn)，要求胚根發(fā)育正常，胚根彎曲并呈螺旋狀盤(pán)繞者不予統(tǒng)計(jì)。7 d后從每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)取20粒發(fā)芽種子，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率。萌發(fā)率=（萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%。

1.2.3? 抗氧化酶活性及丙二醛含量的測(cè)定? 將上述處理中各處理第四天的部分種子取出，放入離心管中冷凍保存，用于酶活性和MDA含量的測(cè)定。POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，以1 min內(nèi)OD470 nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位;CAT活性測(cè)定采用紫外吸收法，以1 min內(nèi)OD240 nm減少0.1的酶量為1個(gè)酶活性單位;SOD活性測(cè)定采用NBT（氮藍(lán)四唑）光化還原法，以抑制NBT光還原50%的酶量為1個(gè)酶活性單位;MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 纖維素降解菌株的分離與形態(tài)學(xué)觀察

利用赫奇遜培養(yǎng)基對(duì)土壤樣品進(jìn)行分離純化后，獲得可以降解纖維素的細(xì)菌23株、放線菌8株、真菌9株。選取不同的放線菌單菌落接種于剛果紅培養(yǎng)基中，通過(guò)檢測(cè)點(diǎn)接3 d后不同菌株的水解圈直徑發(fā)現(xiàn)，不同菌株水解能力不同，其中編號(hào)為1的菌株水解圈直徑最小，僅為1.5 mm，編號(hào)為4的水解圈直徑最大，可達(dá)8.8 mm，具體情況見(jiàn)表1，故后續(xù)菌株鑒定及試驗(yàn)均使用該菌株。

通過(guò)單菌落觀察發(fā)現(xiàn)該菌株菌落直徑3～4 mm，菌落表面呈粉狀，基內(nèi)菌絲為灰白色，氣生菌絲也為灰白色，孢子絲為白色。利用插片法觀察該菌株基內(nèi)菌絲略粗于氣生菌絲，不斷裂，孢子絲生于氣生菌絲上，孢子絲直或稍波曲，以單鏈生為主（圖1），初步判定該菌株屬于鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）。

2.2? 發(fā)酵液對(duì)大豆種子萌發(fā)的影響

由圖2可以看出，大豆種子經(jīng)過(guò)發(fā)酵液濃度為0、16.7%、33.3%、50.0%和100.0%的纖維素降解菌發(fā)酵液處理后，種子萌發(fā)率均高于對(duì)照，相對(duì)提高了19.51、14.66、18.08、5.42和21.96;只有在發(fā)酵液濃度為66.7%時(shí)對(duì)種子萌發(fā)有抑制作用。在發(fā)酵液濃度為100.0%時(shí)，種子的萌發(fā)率達(dá)到最高，為74.53%，與對(duì)照相比提高了21.96個(gè)百分點(diǎn);當(dāng)發(fā)酵液的發(fā)酵液濃度為66.7%時(shí)發(fā)芽率最低，為35.09%。結(jié)果證明，纖維素降解菌發(fā)酵液對(duì)大豆種子有較強(qiáng)的促生作用，且在發(fā)酵液濃度為100.0%時(shí)具有最強(qiáng)的促生作用。

2.3? 發(fā)酵液對(duì)抗氧化酶活性的影響

2.3.1? 發(fā)酵液對(duì)POD活性的影響? 從圖3可以看出，經(jīng)過(guò)不同濃度的纖維素降解菌發(fā)酵液處理后的大豆種子POD活性均較高，當(dāng)發(fā)酵液濃度為100.0%時(shí)，POD活性為25.6 U/（mL·min），與對(duì)照相比提高了101.96%，但與純水培養(yǎng)（發(fā)酵液濃度為0）相比下降了14.65%。

2.3.2? 發(fā)酵液對(duì)CAT活性的影響? 從圖4可以看出，不同濃度纖維素降解菌發(fā)酵液處理后的大豆種子CAT活性不同，在發(fā)酵液濃度為100.0%時(shí)，CAT活性達(dá)到最高，為2.28 /（mL·min），與對(duì)照相比提高了291.45%。在發(fā)酵液濃度為16.7%時(shí)，對(duì)酶活性起到抑制作用，此時(shí)酶活最低，為0.37 U/（mL·min），比對(duì)照下降了37.13%。

2.3.3? 發(fā)酵液對(duì)SOD活性的影響? 由圖5可知，各纖維素降解菌發(fā)酵液濃度對(duì)酶活性均起到促進(jìn)作用，發(fā)酵液濃度為100.0%時(shí)，SOD活性達(dá)到最高，與對(duì)照相比提高了106.64%。

2.3.4? 發(fā)酵液對(duì)MDA含量的影響? 結(jié)果（圖6）表明，除纖維素降解菌發(fā)酵液濃度為16.7%的處理之外，其他處理與對(duì)照相比，MDA含量均無(wú)顯著性差異。當(dāng)發(fā)酵液濃度為16.7%時(shí)，MDA含量達(dá)到最低，與對(duì)照相比降低了21.37%。

3? 小結(jié)與討論

作物種植中的秸稈無(wú)害化處理一直是研究的熱點(diǎn)，秸稈焚燒不僅污染環(huán)境，還會(huì)造成資源浪費(fèi)，也是目前霧霾形成的主要因素之一，因此纖維素降解微生物對(duì)于解決秸稈降解意義重大。長(zhǎng)期以來(lái)，盡管真菌和細(xì)菌對(duì)纖維素降解作用引起普遍關(guān)注，但是放線菌在纖維素分解過(guò)程中的作用不容忽視[10]。劉超等[11]研究發(fā)現(xiàn)，放線菌中的鏈霉菌屬對(duì)纖維素的降解種類較多，對(duì)促進(jìn)纖維素資源化利用具有現(xiàn)實(shí)意義。

另外，秸稈分解產(chǎn)物，尤其是纖維素降解菌對(duì)植株的影響也是近年來(lái)人們比較關(guān)注的內(nèi)容。趙艷婷[12]通過(guò)測(cè)定芽孢桿菌屬菌株AN-6對(duì)玉米幼苗的影響證明，細(xì)菌發(fā)酵液可以促進(jìn)植物幼苗的生長(zhǎng)，并且會(huì)提高作物的抗逆性。大量研究表明，POD、SOD、CAT與植物抗逆過(guò)程密切相關(guān)[13，14]，生物體進(jìn)行一切生命活動(dòng)都伴隨氧代謝同時(shí)產(chǎn)生活性氧，當(dāng)植物處于脅迫條件下，活性氧代謝平衡被打破，產(chǎn)生大量氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），對(duì)細(xì)胞造成損害，從而影響植物正常生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致產(chǎn)量、品質(zhì)下降[15-17]。逆境脅迫引起ROS的積累可以通過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)來(lái)消除，其中SOD、POD與CAT在植物細(xì)胞內(nèi)相互協(xié)調(diào)，能有效清除過(guò)剩的氧自由基引起的膜脂過(guò)氧化及其他傷害[18]，而MDA含量高低是膜脂過(guò)氧化作用強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)[19]。本試驗(yàn)所選取的纖維素降解菌對(duì)大豆種子的萌發(fā)有較好的促進(jìn)作用，經(jīng)過(guò)不同濃度發(fā)酵液處理的大豆種子在萌發(fā)過(guò)程中的SOD、POD和CAT活性均有明顯提高，其中在發(fā)酵液濃度為100.0%時(shí)，促進(jìn)作用相對(duì)最強(qiáng)。MDA含量在發(fā)酵液濃度為16.7%時(shí)最低，證明低濃度的發(fā)酵液對(duì)細(xì)胞膜的損傷作用最小，對(duì)大豆植物細(xì)胞有保護(hù)作用，有利于防御病菌入侵，能有效降低種子萌發(fā)過(guò)程中病害的發(fā)生。

纖維素降解菌發(fā)酵液對(duì)大豆種子萌發(fā)與抗氧化酶活性的多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，其促生與抗逆作用效果穩(wěn)定，因而該發(fā)酵液可能成為增強(qiáng)大豆種子萌發(fā)過(guò)程的抗逆性的生物資源。以上的研究結(jié)果可為以后在生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中更好地利用該菌株降解產(chǎn)物用于大豆生產(chǎn)提供參考。此后，還將繼續(xù)優(yōu)化該纖維素降解菌的培養(yǎng)條件，對(duì)降解能力不同的菌株進(jìn)行復(fù)合，以提高其降解能力，為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)提供重要理論依據(jù)。

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