β -環(huán)糊精增敏熒光法測定氟氰戊菊酯

程 楊， 聶繼云*， 劉紅弟， 閆 震， 匡立學

(中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品質(zhì)量安全風險評估實驗室(興城)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(興城)，遼寧興城 125100)

β-環(huán)糊精(β-Cyclodextrin，β-CD)，它是直鏈淀粉在葡萄糖轉移酶的作用下生成的環(huán)狀低聚糖，具有外親水內(nèi)疏水的圓筒形中空結構，客體分子的疏水基團能夠進入到β-CD的疏水空腔之中，可形成主-客體超分子包合物[1 - 4]，避免去活碰撞，減少分子移動自由度，增加發(fā)射速度常數(shù)，保持適宜的微環(huán)境以及保護激發(fā)態(tài)不與大體積水分子和猝滅劑接觸，從而引起體系熒光顯著增強[5 - 7]。近年來，科研工作者已利用β-CD 增敏熒光法來測定蔬菜和水果中農(nóng)藥殘留[8 - 9]。氟氰戊菊酯(Flucythrinate)是一種非三元環(huán)結構含氟的合成擬除蟲菊酯殺蟲劑，主要應用于棉花、蔬菜、果樹等作物上多種害蟲的防治，對葉螨有一定抑制作用。氟氰戊菊酯具有潛在的神經(jīng)毒性[10]，并且長期接觸可能會引起內(nèi)分泌紊亂等問題[11]。因此，其殘留問題必然會給消費者帶來潛在的危險并引起人們的高度重視。氟氰戊菊酯的測定方法多為氣相色譜法[12 - 13]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14 - 15]。但這些方法操作繁瑣耗時，需要大型儀器和專業(yè)操作人員等缺點限制其應用，因此，建立一種氟氰戊菊酯殘留快速準確的分析方法顯得尤為迫切。

熒光分析法具有實時檢測、靈敏度高、分析快速、操作簡單、試樣用量少等優(yōu)點，使其在農(nóng)藥殘留分析中受到國內(nèi)外學者的廣泛關注，并且在痕量物質(zhì)的檢測方面也具有很好的應用前景[16 - 17]。本文利用熒光光譜法研究了β-CD與氟氰戊菊酯的超分子相互作用，確定了包合比、包合常數(shù)，利用其自身產(chǎn)生的熒光信號，通過β-CD對其的增敏作用，可有效降低氟氰戊菊酯的檢出限，據(jù)此建立一種直接、快速、高靈敏度測定氟氰戊菊酯含量的新方法，為β-CD作為超分子主體化合物對客體分子的熒光增敏效應提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4600型熒光光譜儀(日本，日立公司)；雷磁pHS-3E型數(shù)顯式pH計(上海儀電科學儀器有限公司)；VT6060M真空干燥箱(美國，賽默飛世爾科技公司)。

β-環(huán)糊精(β-CD)(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；氟氰戊菊酯標準品(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所)，二次重結晶，真空干燥后備用；其它試劑均為分析純。所有實驗用水均為高純水。

1.2 溶液的配制

氟氰戊菊酯標準溶液:準確移取1 mL 100 μg/mL氟氰戊菊酯標準品溶液，用95%乙醇稀釋100 mL，然后再稀釋成0.1 μg/mL的標準工作溶液。β-CD溶液:準確稱取2.8375 gβ-CD，用高純水配制成濃度為1.0×10-2mol/L貯備溶液。B-R緩沖溶液:取0.272 mL 85%H3PO4，0.464 mL 36%冰HAc和0.2473 g H3BO3，用高純水配成100 mL的三酸混合液(0.04 mol/L)；將配制好的三酸混合溶液與不同體積NaOH溶液(0.2 mol/L)混合，可得到不同pH的B-R緩沖溶液。

1.3 實驗方法

移取1 mL 0.1 μg/mL的氟氰戊菊酯標準工作液，置于10 mL比色管中，依次加入不同體積的β-CD(1.0×10-2mol/L)的標準溶液，1 mL的B-R緩沖溶液(pH=5.02)，加高純水稀釋至刻度，充分搖勻，室溫下放置5 min后，在λex=251 nm，λem= 306 nm的條件下測定溶液的熒光強度。

2 結果與討論

2.1 氟氰戊菊酯的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜

按照實驗方法，在室溫下進行熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的掃描，掃描波長200～700 nm，掃描速度為2 400 nm/min。最后確定氟氰戊菊酯的λex=251 nm，λem=306 nm，儀器狹縫寬度均為2.5 nm。

2.2 pH值對氟氰戊菊酯熒光強度的影響

采用B -R緩沖溶液考察了pH=1.98～11.20范圍內(nèi)反應體系熒光強度的變化。由圖1可以看出，β-CD包合氟氰戊菊酯的熒光強度在pH為1.98～6.09范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，當體系pH=5.02時，熒光強度達到最大值。本實驗選擇pH=5.02作為體系熒光測定的最佳pH值，B-R緩沖溶液用量為1 mL。

2.3 氟氰戊菊酯與β -CD反應時間對其熒光強度的影響

取按實驗方法配制溶液8份，測定反應不同時間的后熒光強度。氟氰戊菊酯與β-CD的反應在5～40 min內(nèi)，體系的熒光強度變化不大。實驗選擇反應時間5 min為最優(yōu)實驗條件。

2.4 β -CD濃度對氟氰戊菊酯熒光強度的影響

在pH=5.02條件下，固定氟氰戊菊酯的濃度，分別加入不同體積的β-CD。實驗結果表明，氟氰戊菊酯的熒光強度隨著β-CD濃度的增加而增強(圖2)，當加入1.0×10-2mol/Lβ-CD溶液體積達到4 mL時，氟氰戊菊酯熒光強度的增加趨于平緩并達到最大值，這是由于β-CD對氟氰戊菊酯的包合作用所致。本文選擇1.0×10-2mol/Lβ-CD的加入量為4 mL。

圖1 溶液pH對熒光強度的影響Fig.1 The effect of pH on the fluorescence intensity

圖2 β -CD的加入量對于熒光強度的影響Fig.2 The effect of the amount of β -CD on the fluorescence intensity[β -CD]:1.0×10-2 mol/L.1-7:1 mL，1.5 mL，2 mL，2.5 mL，3 mL，3.5 mL，4 mL.inset:Relationship equation curve of β -CD-flucythrinate inclusion complex.

在本實驗中，我們利用Benesi-Hildebrand的雙倒數(shù)法測定β-CD包合常數(shù)，根據(jù)公式[8]，將所得實驗數(shù)據(jù)按1/(F-F0)對1/[CD]作圖，可得線性關系較好的直線:y=2.36923×10-4x+0.0351(R2=0.9985)。實驗結果表明β-CD與氟氰戊菊酯之間形成了1∶1的超分子包合物。由直線的截距與斜率之比可求得(圖2內(nèi)插圖):β-CD與氟氰戊菊酯的結合常數(shù)K=148 L/mol。

圖3 β -CD與氟氰戊菊酯形成包合物的模型Fig.3 A model for the formation of inclusion complexes of β -CD and flucythrinate

由于氟氰戊菊酯的疏水基團在疏水作用、氫鍵力及范德華力等非共價鍵作用的驅動下，進入β-CD疏水空腔形成主-客體包合物，從而導致β-CD對氟氰戊菊酯具有熒光增敏作用，β-CD的空腔尺寸大小與極性對客體分子氟氰戊菊酯進行選擇性識別包合。這種結構模型(圖3)導致氟氰戊菊酯分子的熒光在β-CD疏水空腔中受到屏蔽和保護，減少分子的移動自由度，避免分子間的去活碰撞，體系的熒光強度增加。

2.5 干擾實驗

2.6 工作曲線、檢出限及精密度

在實驗選定的最優(yōu)化條件下，改變氟氰戊菊酯的加入濃度，按照實驗方法繪制標準曲線。實驗結果表明，氟氰戊菊酯的濃度在1～30 ng/mL之間與其熒光強度呈現(xiàn)良好的線性關系(R2=0.9975)，線性回歸方程為:y=4.65x+36.99，計算方法檢出限(3σ/k)為0.25 ng/mL。對20份濃度為0.01 μg/mL的氟氰戊菊酯標準溶液平行測定，其相對標準偏差(RSD)為1.3%。

2.7 實際樣品分析

分別稱取市售蘋果18.95 g，梨13.28 g，分別切成小塊研磨后，用50 mL 95%乙醇浸泡，過濾后轉移至50 mL容量瓶中定容后作為樣品溶液。按照實驗方法，在2支10 mL比色管中分別加入1 mL蘋果和梨樣品溶液，再取另外兩支10 mL比色管，分別加入1 mL蘋果和梨樣品溶液和1 mL濃度為0.1 μg/mL的氟氰戊菊酯標準溶液進行測定，平行測定5次(表1)。從表1結果可以看出，我們建立的基于β-CD熒光光譜法具有很好的測定值和回收率，說明此方法可以應用于水果中氟氰戊菊酯的快速檢測。

表1 水果樣品分析結果(n=5)

3 結論

本文通過β-CD增敏熒光光譜法測定水果中氟氰戊菊酯的含量，該方法的線性范圍為1～30 ng/mL，檢出限為0.25 ng/mL，RSD為1.3%。建立的熒光檢測方法，具有靈敏度高，選擇性好，操作簡便等優(yōu)點，能夠滿足水果中氟氰戊菊酯的檢測要求，尤其適用于小型實驗室的應用研究，對水果中農(nóng)藥殘留的檢測有一定的參考價值。