3-氨基-9-乙基咔唑柱前衍生-高效液相色譜法分析香菇多糖的單糖組成

張 萍*， 陳 燕， 劉建波， 尚永輝， 劉 靜

(咸陽師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院,陜西咸陽 712000)

香菇多糖是一種以β-[1 - 3]葡萄糖殘基為主鏈的葡聚糖化合物，它具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌和抗病毒、抗疲勞、抗氧化和抗衰老、抗輻射等多種藥理活性[1 - 2]，是世界上公認(rèn)的免疫增強(qiáng)劑和干擾素。目前已開發(fā)出香菇多糖營養(yǎng)口服液、藥用針劑等產(chǎn)品，但有關(guān)香菇多糖的單糖組成分析方法研究的文獻(xiàn)不多見。測定多糖的單糖組成普遍采用的是氣相色譜法(GC)[3]、高效液相色譜法(HPLC)[4]以及色譜和質(zhì)譜(GC-MS或HPLC-MS)聯(lián)用法[5 - 6]。GC法樣品處理(衍生化)步驟繁瑣，耗時(shí)長，工作效率不高[7 - 8]，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法儀器不具普遍性，因此這兩類方法在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性。相比之下，HPLC法和柱前衍生化技術(shù)相結(jié)合測定多糖的單糖組成更具實(shí)用性。與之適應(yīng)的糖類衍生化試劑也不斷被開發(fā)[9]，如吡唑啉酮類[10 - 11]、氨基含氮雜環(huán)類[12]、氨基吖啶酮類[13]、芳胺類[14 - 15]等。

3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)是一種在弱酸介質(zhì)中利用還原胺化反應(yīng)對糖類物質(zhì)還原端進(jìn)行標(biāo)記的氨基咔唑類衍生化試劑之一，標(biāo)記上AEC的糖類物質(zhì)具有很強(qiáng)的紫外吸收及熒光性能，在糖類的衍生化中已有應(yīng)用[16 - 17]，但對中性糖和糖醛酸的衍生化效果比較，以及用于香菇多糖的單糖組成分析未見報(bào)道。本文研究了AEC對不同類型單糖的衍生化效果，并據(jù)此建立了AEC柱前衍生-HPLC法分析香菇多糖的單糖組成，給香菇多糖的研究和產(chǎn)品評價(jià)提供了新的方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-10A高效液相色譜儀(日本，島津公司)，配四元梯度泵、UV檢測器和CLASS-VAP色譜工作站；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司)。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品：D(+)葡萄糖(Glc)、D(+)半乳糖(Gal)、D(+)木糖(Xyl)、D -甘露糖(Man)(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，L(+)鼠李糖(Rha)、D -巖藻糖(Fuc)、D -半乳糖醛酸(GalA)、D -葡萄糖醛酸(GlcA)(純度≥99%，Sigma公司)，D -阿拉伯糖(Ara)(純度≥99%，F(xiàn)LUKA公司);3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)(純度95%，上海麥克林生物有限公司)；氰基硼氫化鈉(95%，百靈威科技有限公司)；色譜純乙腈、甲醇(Fisher公司)；冰HAc、二氯甲烷、氨水、無水乙醇等均為分析純(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)。實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液準(zhǔn)確稱取計(jì)算量的各單糖標(biāo)準(zhǔn)品(Glc、Gal、Xyl、Man，Rha、Fuc、GalA、GlcA和Ara)，分別置于5 mL容量瓶中，用水溶解并定容，搖勻后，得0.10 mol/L各單糖儲備液，保存于4 ℃冰箱中，用時(shí)根據(jù)需要混合或用水進(jìn)行稀釋。

1.2.2 AEC衍生化試劑溶液準(zhǔn)確稱量0.6308 g AEC，加入2.0 mL甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶，混勻(濃度為0.3 mol/L)，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中保存?zhèn)溆?。氰基硼氫化鈉溶液：準(zhǔn)確稱量0.0603 g的氰基硼氫化鈉，加入4.0 mL水，溶解，濃度為0.24 mol/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 香菇多糖的提取和純化

取干燥香菇100 g，粉碎，加入乙醇700 mL回流提取兩次，每次2.5 h，抽濾后，殘?jiān)稍?，再加?0倍量水于90 ℃提取兩次，每次2.0 h，提取液合并后減壓濃縮至200 mL左右。冷卻后，加入4倍量無水乙醇，密封保存于4 ℃冰箱靜置醇沉24 h。抽濾，濾餅依次用適量的無水乙醇、丙酮和乙醚依次抽洗，干燥后得褐色香菇粗多糖。

將粗多糖配成質(zhì)量濃度為4%的水溶液，按照糖液∶Sevage試劑氯仿∶正丁醇=4∶1、3∶1(V/V)量加入Sevage試劑，劇烈震搖10 min后，于4 000 r/min 離心10 min，棄去水相與有機(jī)相間的變性蛋白，將上層水相同法反復(fù)操作7次。用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)水相糖溶液pH為8～9，向其中加入一定量30%H2O2，使H2O2濃度達(dá)到5%，混勻后30 ℃水浴2.0 h。將糖溶液裝入預(yù)先處理好的截留分子量為8 000～10 000的透析袋中，先用自來水流水透析48 h，再用高純水透析48 h(期間每6 h更換一次水)。將透析過的糖溶液減壓濃縮至粘液狀，冷卻后，加入4倍量無水乙醇，于4 ℃冰箱靜置醇沉24 h。離心分離后，殘?jiān)来斡眠m量的無水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌分離，干燥后得淺褐色的精制香菇粗多糖。

1.4 單糖的衍生化

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生參考文獻(xiàn)方法[9]并稍加改動(dòng)。分別準(zhǔn)確吸取0.10 mL 0.01 mol/L標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液于2 mL反應(yīng)瓶中，加入0.05 mol/L的AEC衍生化試劑溶液0.10 mL，0.04 mol/L氰基硼氫化鈉溶液0.10 mL，冰HAc 0.05 mL，充分混勻后，擰緊瓶蓋，于70 ℃水浴條件下反應(yīng)1.5 h。冷卻至室溫后，加水0.5 mL，加二氯甲烷1.0 mL，充分振蕩，離心，棄去下層有機(jī)相，水相重復(fù)萃取三次，備HPLC分析。

1.4.2 6種標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的衍生分別準(zhǔn)確移取10 μL 0.1 mol/L的6種單糖溶液于2 mL反應(yīng)瓶中，補(bǔ)加水0.04 mL，分別加入配制好的0.3 mol/L的AEC衍生化試劑溶液100 μL，0.3 mol/L氰基硼氫化鈉溶液0.10 mL，冰HAc 50 μL。擰緊瓶蓋，于70 ℃水浴條件下反應(yīng)1.5 h。冷卻至室溫后，加超純水0.5 mL，加二氯甲烷1.0 mL，充分振蕩，離心，棄去下層二氯甲烷相，水相重復(fù)萃取三次，備HPLC分析。

1.5 香菇多糖的水解

稱取香菇多糖5 mg于帶螺旋塞密封的樣品小瓶中，加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸(TFA)，在120 ℃條件下加熱反應(yīng)2 h，冷卻后，轉(zhuǎn)移至玻璃套管中，抽干，加入1.0 mL水溶解，得香菇多糖水解液。

1.6 香菇多糖樣品測試液的制備

取香菇多糖水解液100 μL于5 mL反應(yīng)瓶中，同1.4.2方法步驟加入100 μL 0.3 mol/L 的AEC衍生化試劑溶液，以及冰HAc 50 μL，同法進(jìn)行AEC衍生化和后處理，將含衍生物的水相過0.45 μm濾膜后，進(jìn)行HPLC分析。

1.7 HPLC分析條件

色譜柱為Ultimate LP-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L NH4Ac溶液(pH=5.0)，采用乙腈含量從20%開始，維持2 min后，再在50 min之內(nèi)增加至30%，之后維持30%不變的梯度洗脫程序；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 AEC對不同類型單糖的衍生效果評價(jià)

研究中分別對Man、Gal、Rha和Glc 4種六碳糖，Ara和Xyl 2種五碳糖，以及GlcA和GalA 2種酸性糖在相同條件下，按照1.4.1方法進(jìn)行AEC衍生，衍生產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析。能代表三種類型單糖的Glc、Ara以及GalA衍生物的HPLC譜圖如圖1。由圖1可見，AEC對Glc和Ara兩種中性糖的衍生產(chǎn)物只出現(xiàn)一個(gè)對稱的色譜峰，說明該衍生產(chǎn)物具有惟一性；而對GalA的衍生產(chǎn)物出現(xiàn)了2種相鄰而且峰形不規(guī)則的峰，GlcA也有類似情況，說明衍生產(chǎn)物可能有2種；從縱坐標(biāo)的響應(yīng)值也可以看出，中性糖衍生物的響應(yīng)值幾乎是酸性糖的5～8倍。說明AEC對中性糖的衍生效果大于酸性糖?？赡苁怯捎贏EC和還原性單糖的衍生化反應(yīng)是在加熱70 ℃的弱酸性介質(zhì)中進(jìn)行的，而酸性糖在此條件下容易發(fā)生分子內(nèi)脫水而形成內(nèi)酯，從而導(dǎo)致衍生化出現(xiàn)2種無法量化的產(chǎn)物峰。因此，AEC適合于對中性糖的衍生化，不太適合對以糖醛酸為代表的酸性糖進(jìn)行衍生化。

圖1 AEC對不同類型單糖衍生物的色譜圖Fig.1 Chromatograms for different types of monosaccharide -AEC derivatives

2.2 AEC-中性單糖衍生物穩(wěn)定性考察

實(shí)驗(yàn)中對由1.4.1方法衍生得到的Glc-AEC衍生溶液分別放置24、48、72、96、120 h 后進(jìn)行分析測定，記錄色譜峰面積，考察衍生物的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，Glc-AEC衍生液一周內(nèi)日間色譜峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.69%。表明單糖-AEC衍生物在一周之內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 6種中性單糖-AEC衍生物色譜分離條件選擇

2.3.1 流動(dòng)相pH參考文獻(xiàn)報(bào)道[16]，選取乙腈-0.05 mol/L NH4Ac溶液為流動(dòng)相體系的條件下，NH4Ac溶液pH分別為4.0、4.5、5.0時(shí)對6種中性單糖-AEC混合衍生物分離的影響。結(jié)果表明：隨著pH從4.0增大至5.0，6種中性單糖-AEC混合衍生物的分離逐漸改善，同時(shí)，出峰時(shí)間隨之推遲；在pH為5.0時(shí)，Man和Gal的分離得到改善，其它峰均得到了完全分離。故確定流動(dòng)相的pH為5.0。

圖2 6種中性單糖-AEC混合衍生物的色譜圖Fig.2 Chromatogram of six neutral monosaccharide-AEC derivativesa.Gal；b.Man；c.Glc；d.Ara；e.Xyl；f.Rha.

2.3.2 流動(dòng)相中乙腈比例對分離的影響以乙腈-0.05 mol/L NH4Ac溶液(pH=5.0)為流動(dòng)相體系，比較了乙腈比例由20%變到30%時(shí)對6種中性單糖-AEC混合衍生物分離的影響。結(jié)果表明，當(dāng)乙腈含量為20%時(shí)，6種中性單糖-AEC衍生物均達(dá)到了很好的分離，但出峰時(shí)間長達(dá)90 min；當(dāng)乙腈含量為30%時(shí)，所有單糖-AEC衍生物均在25 min之內(nèi)出峰，但分離度不佳。綜合考慮分離度和出峰時(shí)間，采用梯度洗脫，梯度程序見1.7節(jié)。由圖2可見，梯度洗脫程序下Gal和Man的分離得到了改善，6種中性單糖均得到了滿意的分離。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍和檢出限分別將濃度為0.05、0.10、0.25、0.50、0.67、1.00、2.00、10.00 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)單糖混合溶液，按照1.4.2方法分別進(jìn)行AEC衍生化，并按照1.7的HPLC分析條件進(jìn)行檢測，記錄各個(gè)濃度下6種單糖-AEC衍生物的色譜峰面積。根據(jù)各單糖峰面積和對應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸，得到的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表1。以0.05 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)單糖混合溶液得到的色譜信息為依據(jù)，按照色譜曲線中信噪比(S/N)等于3計(jì)算，確定6種單糖的檢測限，結(jié)果一并列于表1。

表1 6種單糖的線性范圍和檢出限(n=3)

*Y:denotes the chromatographic peak area;X:denotes the concentration of standard monosaccharides.

2.4.2 回收率和精密度試驗(yàn)按照1.5方法進(jìn)行水解得到香菇多糖樣品水解液。取樣品水解液50 μL和50 μL水4份于4個(gè)樣品瓶中，依次加入0.10 mol/L的6種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、5和8 μL，使各標(biāo)準(zhǔn)單糖添加量依次為0、2.00、5.00和8.00 mmol/L。按照1.4.2方法步驟進(jìn)行衍生化。按照1.7色譜條件進(jìn)行分析測定，結(jié)果見表2。

表2 6種單糖回收率分析結(jié)果(n=3)

*:TheRSDaveragevaluesofeachmonosaccharidearelistedinparentheses.

2.5 香菇多糖的單糖組成分析結(jié)果

為了表明方法的實(shí)際應(yīng)用性能，將其用于香菇多糖的單糖組成分析中。按照1.6方法步驟，對香菇多糖進(jìn)行了單糖組成分析。結(jié)果表明：香菇多糖含有本法考察的6種單糖，分別為：Man、Rha、Glc、Gal、Ara和Xyl。將各單糖峰面積帶入線性方程，計(jì)算其摩爾量，并按照半乳糖摩爾量歸一，確定香菇多糖中各單糖摩爾比為：4.69(Man)∶1.23(Ara)∶1.00(Gal)∶0.48(Glc)∶0.17(Rha)∶0.14(Xyl)。該結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[18]結(jié)果有一定的吻合性，進(jìn)一步證明了該方法的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

研究了AEC對不同類型單糖的衍生化效果，以及單糖-AEC衍生物的穩(wěn)定性，建立了AEC柱前衍生-HPLC法分析6種中性單糖的分析方法。該方法對中性單糖的衍生效果較好，衍生物穩(wěn)定性高，測定的線性范圍寬，靈敏度高，重復(fù)性好，測定香菇多糖的單糖組成分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于香菇多糖和其它多糖單糖組成的測定。