組織蛋白酶S對(duì)HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙的調(diào)控作用及其機(jī)制研究

羅 漣 師金川 顏廷波 倪霜玲 周佳君

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是世界上首要的公共衛(wèi)生問題，截止2015年底，全球已有AIDS患者近400萬，其中我國50余萬人[1]。在我國，HIV感染者中HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙(HIV-associated neurocognitive disorders，HAND)已達(dá)40%。HAND已成為HIV感染者死亡的重要原因，尋找早期識(shí)別、診斷、治療HAND的方法成為當(dāng)下迫切需要解決的問題。有研究顯示，HIV患者半胱氨酸組織蛋白酶S(cathepsin S，CTSS)水平升高，并與腦脊液中HIV-1載量呈正相關(guān)[2]。而其內(nèi)源性抑制劑胱抑素C(cystatin C，Cys C)在HAND患者中水平下降[3]。有研究者認(rèn)為，CTSS可能通過促進(jìn)gp120與CD4結(jié)合，進(jìn)而加速病毒與宿主細(xì)胞的膜融合，從而導(dǎo)致HAND的發(fā)生與進(jìn)展[4,5]。本研究擬通過對(duì)HAND患者與non-HAND患者腦脊液和血漿進(jìn)行檢測(cè)，分析其CTSS、Cys C表達(dá)水平和HIV RNA、gp120蛋白水平，從而明確HAND患者CTSS、Cys C表達(dá)水平的特征性改變及與HIV病毒載量、HIV表面蛋白gp120的關(guān)系，分析CTSS、Cys C水平與疾病發(fā)生的相關(guān)性，為HAND預(yù)防和治療提供新的思路及理論依據(jù)。

資料與方法

1.一般資料:選擇自2015年6月～2017年6月期間在筆者醫(yī)院治療的30例HAND患者作為研究對(duì)象，HAND的診斷標(biāo)準(zhǔn)：聯(lián)合運(yùn)用國際HIV癡呆量表(IHDS)、Hopkins言語學(xué)習(xí)測(cè)試、利手和非利手Grooved Pegboard實(shí)驗(yàn)(Grooved Pegboard dominant and non-dominant Hands)、接龍?jiān)囼?yàn)A和B(trail making test: parts A and B)、中國修訂韋氏成人智力量表(Wechsler Adult Intelligence Scale-Revised by China, WAIS-RC)進(jìn)行診斷[6,7]。其中，男性21例，女性9例，患者年齡18～50歲，平均年齡35.75±9.43歲。選擇30例HIV非神經(jīng)認(rèn)知功能障礙患者(non-HAND)作為對(duì)照，其中，男性20例，女性10例，患者年齡18～48歲，平均年齡36.04±8.97歲。HAND組和non-HAND組患者年齡、性別等一般資料之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～50歲，男女性別不限；②市疾控中心檢測(cè)確診HIV陽性的AIDS患者；③小學(xué)及以上文化程度；④意識(shí)清楚，能配合完成量表檢查；⑤既往無精神疾病史，無精神病陽性家族史；⑥患者或其法定監(jiān)護(hù)人自愿參加并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①活動(dòng)性心理障礙；②活動(dòng)性或既往中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)會(huì)性感染；③乙醇中毒；④既往吸食過鴉片、大麻、可卡因、海洛因等毒品或毒品成癮者；⑤肢體殘疾(如截肢)、嚴(yán)重機(jī)能障礙或嚴(yán)重內(nèi)科疾病而影響神經(jīng)心理測(cè)試。本研究獲得了筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有受試者均簽署了知情同意書。

2.腦脊液和血漿中CTSS mRNA、Cys C mRNA和HIV RNA水平檢測(cè)：以無菌方法取所有入組患者腦脊液3～5ml，凍存于-80℃冰箱中待測(cè)。采集EDTA抗凝靜脈血即刻1800r/min 離心分離血漿，凍存于-80℃冰箱中待測(cè)。從-80℃冰箱中取出腦脊液和血漿樣品，分成2份，其中1份用于檢測(cè)CTSS mRNA、Cys C mRNA和HIV RNA水平，使用RNA提取試劑盒(貨號(hào)：4449079，批號(hào)：2015020301，美國Thermo Fisher Scientific公司)提取CTSS mRNA、Cys C mRNA，HIV RNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(貨號(hào)：K1622，美國Fermentas公司)合成cDNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒(貨號(hào)：10928042，批號(hào)：201501057，美國Thermo Fisher Scientific公司)檢測(cè)CTSS mRNA、Cys C mRNA和HIV RNA水平，以GAPDH mRNA作內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析mRNA或RNA的相對(duì)表達(dá)水平。另一份腦脊液和血漿樣品用于檢測(cè)CTSS、Cys C、gp120蛋白水平。

3.腦脊液和血漿中CTSS、Cys C、gp120蛋白水平：取另一份腦脊液和血漿樣品，使用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測(cè)腦脊液和血漿中CTSS、Cys C、gp120蛋白水平，CTSS、Cys C蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒購于英國Abcam公司，貨號(hào)分別為ab155427、ab119589，批號(hào)分別為A201801042、A201802041。gp120蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司，貨號(hào)為SBJ-H1622，批號(hào)為20180304251。所有試劑盒檢測(cè)操作方法均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，每個(gè)樣本檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔。

結(jié) 果

1.腦脊液中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平:HAND組患者腦脊液中CTSS mRNA、CTSS蛋白、HIV RNA和gp120蛋白水平均顯著高于non-HAND組，而Cys C mRNA和Cys C蛋白水平顯著低于non-HAND組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，詳見表1。

表1 HAND組和non-HAND組腦脊液中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平比較

2.血漿中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平:HAND組患者血漿中CTSS mRNA、CTSS蛋白、HIV RNA和gp120蛋白水平均顯著高于non-HAND組，而Cys C mRNA和Cys C蛋白水平顯著低于non-HAND組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，詳見表2。

表2 HAND組和non-HAND組血漿中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平比較

3.CTSS表達(dá)水平與HIV RNA相關(guān)性:腦脊液(CSF)中CTSS mRNA水平與HIV RNA水平(r=0.61)、CTSS蛋白水平與HIV RNA水平(r=0.60)以及血漿中CTSS mRNA水平與HIV RNA水平(r=0.53)、CTSS蛋白水平與HIV RNA水平(r=0.60)均呈正相關(guān)，詳見圖1。

圖1 CTSS表達(dá)水平與HIV RNA水平相關(guān)性

4.CTSS表達(dá)水平與gp120相關(guān)性:腦脊液(CSF)中CTSS mRNA水平與gp120蛋白水平(r=0.79)、CTSS蛋白水平與gp120蛋白水平(r=0.64)以及血漿中CTSS mRNA水平與gp120蛋白水平(r=0.64)、CTSS蛋白水平與gp120蛋白水平(r=0.59)均呈正相關(guān)，詳見圖2。

5.Cys C表達(dá)水平與HIV RNA相關(guān)性:腦脊液(CSF)中Cys C mRNA水平與HIV RNA水平(r=-0.71)、Cys C蛋白水平與HIV RNA水平(r=-0.50)以及血漿中Cys C mRNA水平與HIV RNA水平(r=-0.52)、Cys C蛋白水平與HIV RNA水平(r=-0.43)均呈負(fù)相關(guān)，詳見圖3。

6.Cys C表達(dá)水平與gp120蛋白相關(guān)性:腦脊液(CSF)中Cys C mRNA水平與gp120蛋白水平(r=-0.76)、Cys C蛋白水平與gp120蛋白水平(r=-0.36)以及血漿中Cys C mRNA水平與gp120蛋白水平(r=-0.44)、Cys C蛋白水平與gp120蛋白水平(r=-0.57)均呈負(fù)相關(guān)，詳見圖4。

圖2 CTSS表達(dá)水平與gp120蛋白水平相關(guān)性

圖3 Cys C表達(dá)水平與HIV RNA水平相關(guān)性

圖4 Cys C表達(dá)水平與gp120蛋白水平相關(guān)性

討 論

HIV病毒除了破壞免疫系統(tǒng)，它還引發(fā)神經(jīng)認(rèn)知疾病[8,9]。高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active anti-retroviral therapy，HAART)是目前臨床上治療艾滋病最有效的方法，降低了發(fā)生率和病死率，但HAND發(fā)生率并未改善。2016年，F(xiàn)ields等[10]研究顯示，HAND的發(fā)生率可達(dá)到50%左右。HAND的早期診斷和治療顯然已經(jīng)迫在眉睫。

目前，關(guān)于HIV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病機(jī)制尚未明確，其研究集中于HIV直接或間接對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷以及宿主發(fā)生免疫應(yīng)答導(dǎo)致的神經(jīng)毒性作用[11,12]。受HIV-1感染的單核-吞噬細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞可釋放病毒蛋白如Tat、Vpr、Nef，以及囊膜糖蛋白Env的表面蛋白gp120和跨膜蛋白gp41等，均可參與直接的中樞神經(jīng)毒性反應(yīng)[13]。而HAND的間接發(fā)病機(jī)制與小膠質(zhì)細(xì)胞、腦巨噬細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎性細(xì)胞因子造成的炎性反應(yīng)及腦屏障的通透性改變有關(guān)[14]。以上兩種致病機(jī)制最終均是通過神經(jīng)細(xì)胞的凋亡而引起HAND。

半胱氨酸組織蛋白酶S(cathepin S，CTSS)是半胱氨酸組織蛋白酶家族中的成員，具有降解細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外基質(zhì)的功能，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性[15]。有研究發(fā)現(xiàn)CTSS抑制劑對(duì)腦外傷小鼠具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，提示CTSS可能是治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的一個(gè)潛在分子靶標(biāo)[16]。CTSS表達(dá)水平與內(nèi)源性抑制劑胱抑素C(cystatin C，Cys C)呈正相關(guān)，CTSS/Cys C比例平衡維持其生理功能[17]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，cystatin C在HAND患者CSF中水平下降[18]。而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示cystatin C具有抗HIV作用，進(jìn)一步提示CTSS在HAND的發(fā)病過程中起到重要作用[19]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HAND患者的腦脊液和血漿中CTSS表達(dá)水平顯著高于non-HAND患者，同時(shí)HIV病毒載量和gp120蛋白表達(dá)水平也顯著高于non-HAND患者，而筆者檢測(cè)Cys C蛋白表達(dá)水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HAND患者腦脊液和血漿中CysC蛋白表達(dá)水平均顯著降低，與Laspiur等[18]研究結(jié)果一致。由此結(jié)果可以看出，HAND患者腦脊液和血漿中CTSS表達(dá)水平與HIV病毒載量以及gp120蛋白水平均呈正相關(guān)，而Cys C表達(dá)水平與HIV病毒載量和gp120蛋白表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)。gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過非共價(jià)作用結(jié)合。在病毒入侵過程里，gp120結(jié)合細(xì)胞表面受體CD4和復(fù)合受體CCR5或CXCR4，觸發(fā)Env巨大的構(gòu)象變化，然后gp41膜融合蛋白又通過一連串的大范圍的蛋白質(zhì)重折疊，最終導(dǎo)致病毒與宿主細(xì)胞的膜融合[20]。筆者分析認(rèn)為CTSS表達(dá)對(duì)抗原遞呈和組織重構(gòu)中的胞內(nèi)和胞外蛋白轉(zhuǎn)換相關(guān)，CTSS可能通過促進(jìn)gp120與CD4結(jié)合，進(jìn)而加速病毒與宿主細(xì)胞的膜融合，從而導(dǎo)致HAND的發(fā)生與進(jìn)展。而以CTSS為靶標(biāo)，通過干預(yù)CTSS表達(dá)水平，以糾正CTSS/Cys C這一失衡狀態(tài)為切入點(diǎn)可能為HAND治療提供新的思路。

本研究存在以下不足之處，首先由于技術(shù)手段限制未能檢測(cè)CD4+、CD8+、CD3+淋巴細(xì)胞水平,其次沒有檢測(cè)隨訪結(jié)果，因此未能就HAND緊張情況做進(jìn)一步研究；最后，由于樣本量較小，相關(guān)研究結(jié)果需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。綜上所述，HAND患者體內(nèi)CTSS水平較高，Cys C水平較低，CTSS可能促進(jìn)HIV與宿主細(xì)胞膜的融合從而促進(jìn)HAND的發(fā)展，但還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。