健脾益氣攝血顆粒影響免疫性血小板減少癥患者出血與免疫功能研究

郎海燕 張 玲 王 佳 張雅月 王 沖 范秋月 張佳諾 陳信義

原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一類由細胞和體液免疫異常導(dǎo)致血小板破壞增多的自身免疫病[1]。ITP臨床表現(xiàn)以廣泛的皮膚、黏膜出血為主，急性發(fā)病者可出現(xiàn)危及生命的內(nèi)臟出血或腦出血，且出血風險隨年齡的增加而增加，但與患者外周血小板數(shù)量減少程度并不一致，尤其慢性患者甚至血小板計數(shù)不在安全水平，也不會發(fā)生廣泛或嚴重出血。因此，對于ITP的治療除有效地防治出血癥狀，穩(wěn)定外周血小板數(shù)值在安全水平外，控制或改善患者臨床癥狀，特別是乏力癥狀至關(guān)重要。通過臨床實踐證明，以中醫(yī)藥為主或輔助治療在防治ITP患者出血、穩(wěn)定外周血小板數(shù)值以及改善臨床癥狀等方面具有明顯優(yōu)勢。因此，筆者在協(xié)作進行國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(“973”計劃)項目臨床試驗過程中，分別檢測了患者經(jīng)健脾益氣攝血顆粒治療前后血小板相關(guān)抗體、T淋巴細胞及其亞群變化，以期證實健脾益氣攝血顆粒具有免疫調(diào)控效果。

對象與方法

1.病例標準:(1)免疫性血小板減少癥診斷標準:參照《血液病診斷及療效標準》制定的ITP診斷標準[2]：①多次實驗室檢查血小板計數(shù)減少；②脾臟不增大或僅輕度增大；③骨髓檢查巨核細胞增多或正常，有成熟障礙；④以下5點中應(yīng)具備任何1點：A.潑尼松治療有效；B.切脾治療有效；C.PAIgG(血小板抗體IgG)增多；D.PAC3(血小板抗體補體C3)增多；E.血小板壽命縮短；⑤并可排除繼發(fā)性血小板減少癥。(2)脾不統(tǒng)血證診斷標準:參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中“中藥新藥治療脾虛證臨床研究指導(dǎo)原則”與“中藥新藥治療氣虛證臨床研究指導(dǎo)原則”[3]，結(jié)合疾病臨床特征擬定“脾不統(tǒng)血證”標準[4]：①主癥：慢性出血(反復(fù)皮下瘀點或瘀斑，色澤淡；月經(jīng)過多或經(jīng)期延長等)，伴隨體倦乏力、神疲懶言；②次癥：食欲不振、食后腹脹；③舌脈：舌體胖大，邊有齒印，舌淡；脈象細弱。具備主癥2項(第1項必備)，次癥1項，結(jié)合舌脈可診斷。(3)出血程度與血小板減少分級標準:參照2010年衛(wèi)生部醫(yī)政司發(fā)布的《免疫性血小板減少性紫癜臨床路徑》，將出血程度與血小板計數(shù)減少分4級并記分，見表1[5]。(4)納入病例標準:同時具備下列3項：①符合免疫性血小板減少癥疾病診斷標準；②符合中醫(yī)“脾不統(tǒng)血”中醫(yī)證候辨證標準；③自愿受試，并簽署知情同意書。(5)排除病例標準:具備下列任意1項：①合并嚴重心臟、腦、肝臟、腎臟疾??；②精神病患者；③妊娠、哺乳期婦女；④有嚴重糖尿病、高血壓并發(fā)癥患者；⑤已知對受試藥物或處方中某個單味中藥過敏者。(6)中止和剔除病例標準：符合下列任意1項：①不能堅持治療；②臨床試驗中出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)或嚴重并發(fā)癥；③病情加重，需另行治療。

表1 血小板計數(shù)減少與出血程度分級記分標準

2.研究方法：(1)臨床分組與治療方法:用中國中醫(yī)科學院臨床評價中心設(shè)計的中央隨機系統(tǒng)，按隨機抽取的藥物編號將受試者分配到健脾益氣攝血顆粒組(試驗組)、健脾益氣攝血顆粒聯(lián)合潑尼松組(聯(lián)合組)、潑尼松組(西藥組)。健脾益氣攝血配方顆粒(黃芪20g、黨參15g、茯苓15g、白術(shù)10g、阿膠15g、茜草10g、炙甘草6g；北京康仁堂藥業(yè)有限公司)，每次1袋，每日2次；潑尼松首次劑量按1.0～1.5mg/(kg·d)，早8：00時頓服，治療期間有效減量。健脾益氣攝血聯(lián)合強的松組聯(lián)合使用健脾益氣攝血配方顆粒和潑尼松(用量用法同上)。21天為1個療程。(2) 觀察指標檢測方法：于第1、7、14、21天進行訪視，觀察患者出血程度變化，并采集患者外周血，應(yīng)用全自動血細胞分析儀器檢測外周血象中血小板計數(shù)，進行血小板減少程度評分值；于第1、4次訪視點，采集患者外周血，送北京海思特臨床檢驗所，按T淋巴細胞亞群檢測試劑盒說明，流式細胞儀法檢測淋巴細胞及其相關(guān)亞群；以酶聯(lián)免疫競爭抑制法(ELISA)檢測血小板相關(guān)抗體(PAIgG、PAIgA、PAIgM)。

3.統(tǒng)計學方法：同一組治療前后比較若差值符合正態(tài)分布，采用配對t檢驗；若前后差值非正態(tài)分布，采用符號Wilcoxon秩和檢驗。組間比較時，若同時符合正態(tài)分布且方差齊，則采用ANOVA單因素方差分析；若各組均正態(tài)分布但方差不齊，采用Welch檢驗；若非正態(tài)分布，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。頻數(shù)及構(gòu)成比的檢驗采用χ2檢驗/Fisher確切概率法(當理論頻數(shù)<5的單元數(shù)超過20%時)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.一般資料:采用中國中醫(yī)科學院臨床所設(shè)計的中央隨機系統(tǒng)，按照臨床試驗方案規(guī)定入選病例標準，自2012年8月～2016年8月，由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院等18家三級甲等中醫(yī)醫(yī)療單位競爭入組ITP患者273例，經(jīng)反復(fù)核對臨床試驗資料，有1例因不符合入選標準而剔除，進入全分析集受試者共272例(試驗組104例，聯(lián)合組103例，西藥組65例)。入組時人口學資料見表2。

表2 3組病例入組時人口學資料

2.出血程度與血小板計數(shù)減少評分值變化：3組病例出血與血小板計數(shù)減少評分值觀察結(jié)果見表3。

表3 3組病例出血程及血小板計數(shù)減少評分值比較分)

與治療前比較，*P<0.05；與試驗組相同時間點比較，#P<0.05；與西藥組相同時間點比較，△P<0.05

從治療第7天開始，試驗組、聯(lián)合組的出血程度評分值較入組時明顯下降，與治療前比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而西藥組從14天開始積分下降。說明西藥組止血效果晚于試驗組、聯(lián)合組。3組病例治療后各訪視點血小板計數(shù)減少程度評分值較治療前有所下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。末次訪視點，聯(lián)合組血小板評分值下降幅度最優(yōu)，與試驗組相同時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.T淋巴細胞亞群測定值變化:3組病例T淋巴細胞亞群檢入結(jié)果見表4。試驗組CD4+CD25+治療后測定值與治療前比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

4.T淋巴細胞亞群正常和異常比例:3組病例T淋巴細胞亞群正常和異常百分比統(tǒng)計結(jié)果見表5。

表4 3組病例T淋巴細胞亞群測定值比較

與治療前比較，*P<0.05；與試驗組治療后比較，△P<0.05

第4次訪視點聯(lián)合組檢測的CD3+CD4+細胞、CD19+細胞正常和異常例數(shù)，與試驗組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

5.血小板相關(guān)抗體變化：3組病例血小板相關(guān)抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM檢測結(jié)果見表6。各組治療前后血小板抗體測定值組內(nèi)或組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

討 論

ITP的確切發(fā)病機制目前尚不清晰，目前普遍認為該病為異質(zhì)性免疫性疾病，體液與細胞免疫功能失調(diào)承擔著始動角色。在體液免疫方面，抗體介導(dǎo)的血小板破壞被認為是ITP的經(jīng)典發(fā)病機制，現(xiàn)已證實50%～60%的ITP患者血小板表面可檢測到抗血小板糖蛋白的血小板自身抗體，包括血小板相關(guān)抗體(PAIg)和血小板特異性抗體(PSIg)。這些抗體主要是IgG型，也有IgM、IgA等?？贵w與血小板膜抗原結(jié)合后形成抗原抗體復(fù)合物，由單核-吞噬細胞攝取后在脾臟中被破壞。吳意紅等[6]研究發(fā)現(xiàn)，歸脾丸不僅能夠提高患者外周血小板計數(shù)，亦能降低血小板相關(guān)抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM，總體療效與激素相當。B細胞通常作為抗原遞呈細胞產(chǎn)生抗體，促進CD4+T細胞分化，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，也可以通過分泌調(diào)節(jié)細胞因子或通過細胞與細胞接觸，直接與病原的T細胞相互作用，從而在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。這類B細胞被稱作調(diào)節(jié)性B細胞[7，8]。細胞免疫異常在ITP發(fā)生、發(fā)展過程中也有重要作用，調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的特殊T細胞亞群。有研究表明，ITP患者存在Treg細胞數(shù)量及功能的異常[9,10]，與正常對照比較，ITP 患者尤其是活動性和(或)血小板計數(shù)特別低的患者，外周Treg數(shù)量明顯減少。目前研究較多的是檢測CD4+CD25+Treg細胞，其是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種特殊的專職免疫調(diào)節(jié)細胞，主要通過抑制免疫效應(yīng)細胞增殖、分化及其免疫功能和抑制自然殺傷細胞、細胞毒T細胞等細胞的功能來維持自身免疫平衡。有研究者通過不同實驗方法均得出一致結(jié)論，初診和復(fù)發(fā)的ITP患者體內(nèi)CD4+和CD25+Treg細胞明顯低于正常對照組和緩解期ITP患者，表明ITP患者體內(nèi)可能由于缺乏Treg細胞，從而使自身免疫反應(yīng)不能被有效抑制，導(dǎo)致自身免疫平衡失調(diào)[11]。Arandi等[12]報道，ITP患者CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞數(shù)量明顯減少，功能降低。吳曉勇等[13]建立ITP小鼠動物模型，檢測脾Treg細胞，發(fā)現(xiàn)Treg細胞比例減少、TGF-β1水平降低與ITP的細胞免疫失調(diào)相關(guān)。上述研究充分證明，T、B細胞免疫功能紊亂在ITP發(fā)病機制中占有重要位置。

表5 3組病例T淋巴細胞亞群正常與異常病例數(shù)比較 [n(%)]

與試驗組比較，*P<0.01；治療前后正常/異常應(yīng)等于本組入組病例數(shù)，本表治療前后病例數(shù)少于入組病例數(shù)均為該項目檢測的缺失病例數(shù)

表6 3組病例治療前后血小板抗體測定值比較(ng/ml)

本研究從治療第7天開始，試驗組、聯(lián)合組的出血程度評分值較入組時明顯下降，與治療前比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而西藥組從14天開始。說明西藥組止血效果晚于試驗組、聯(lián)合組；3組病例治療后各訪視點血小板計數(shù)減少程度評分值較治療前有所下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。末次訪視點，聯(lián)合組血小板評分值下降幅度最優(yōu)，與試驗組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該項研究從臨床角度證明，益氣健脾攝血顆粒對ITP有明確的治療效果。試驗組CD4+CD25+細胞療后測定值與療前比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明健脾益氣攝血顆粒能夠升高CD4+CD25+細胞，調(diào)節(jié)ITP患者紊亂的免疫機制，維系自身免疫穩(wěn)態(tài)。與試驗組比較，第4次訪視點聯(lián)合組檢測的CD3+CD4+、CD19+正常和異常差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CD3+代表人體細胞免疫功能狀態(tài)，CD4+是調(diào)控免疫反應(yīng)最重要樞紐細胞，CD19+則與B細胞免疫相關(guān)。 從上述結(jié)果進一步證實聯(lián)合組不但能夠調(diào)節(jié)T細胞免疫，也可調(diào)控B細胞免疫。各組治療前后血小板抗體測定值組內(nèi)或組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其研究結(jié)果與何牧卿等[14]、Sakakura等[15]臨床研究結(jié)論相一致。該研究結(jié)果可以說明，調(diào)節(jié)免疫尤其是調(diào)節(jié)T細胞免疫可能是健脾益氣攝血顆粒治療ITP機制之一。但由于治療時間僅21天，尚不能按照ITP療效評定標準判定療效。同時，本研究中T細胞及其亞群以及血小板相關(guān)抗體觀察結(jié)果尚不能提供健脾益氣攝血顆粒具有明確調(diào)節(jié)免疫功能相關(guān)證據(jù)，有待于進一步開展臨床或基礎(chǔ)實驗進行彌補或輔助說明。