郎海燕 張 玲 王 佳 張雅月 王 沖 范秋月 張佳諾 陳信義
原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia,ITP)是一類由細胞和體液免疫異常導(dǎo)致血小板破壞增多的自身免疫病[1]。ITP臨床表現(xiàn)以廣泛的皮膚、黏膜出血為主,急性發(fā)病者可出現(xiàn)危及生命的內(nèi)臟出血或腦出血,且出血風險隨年齡的增加而增加,但與患者外周血小板數(shù)量減少程度并不一致,尤其慢性患者甚至血小板計數(shù)不在安全水平,也不會發(fā)生廣泛或嚴重出血。因此,對于ITP的治療除有效地防治出血癥狀,穩(wěn)定外周血小板數(shù)值在安全水平外,控制或改善患者臨床癥狀,特別是乏力癥狀至關(guān)重要。通過臨床實踐證明,以中醫(yī)藥為主或輔助治療在防治ITP患者出血、穩(wěn)定外周血小板數(shù)值以及改善臨床癥狀等方面具有明顯優(yōu)勢。因此,筆者在協(xié)作進行國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(“973”計劃)項目臨床試驗過程中,分別檢測了患者經(jīng)健脾益氣攝血顆粒治療前后血小板相關(guān)抗體、T淋巴細胞及其亞群變化,以期證實健脾益氣攝血顆粒具有免疫調(diào)控效果。
1.病例標準:(1)免疫性血小板減少癥診斷標準:參照《血液病診斷及療效標準》制定的ITP診斷標準[2]:①多次實驗室檢查血小板計數(shù)減少;②脾臟不增大或僅輕度增大;③骨髓檢查巨核細胞增多或正常,有成熟障礙;④以下5點中應(yīng)具備任何1點:A.潑尼松治療有效;B.切脾治療有效;C.PAIgG(血小板抗體IgG)增多;D.PAC3(血小板抗體補體C3)增多;E.血小板壽命縮短;⑤并可排除繼發(fā)性血小板減少癥。(2)脾不統(tǒng)血證診斷標準:參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中“中藥新藥治療脾虛證臨床研究指導(dǎo)原則”與“中藥新藥治療氣虛證臨床研究指導(dǎo)原則”[3],結(jié)合疾病臨床特征擬定“脾不統(tǒng)血證”標準[4]:①主癥:慢性出血(反復(fù)皮下瘀點或瘀斑,色澤淡;月經(jīng)過多或經(jīng)期延長等),伴隨體倦乏力、神疲懶言;②次癥:食欲不振、食后腹脹;③舌脈:舌體胖大,邊有齒印,舌淡;脈象細弱。具備主癥2項(第1項必備),次癥1項,結(jié)合舌脈可診斷。(3)出血程度與血小板減少分級標準:參照2010年衛(wèi)生部醫(yī)政司發(fā)布的《免疫性血小板減少性紫癜臨床路徑》,將出血程度與血小板計數(shù)減少分4級并記分,見表1[5]。(4)納入病例標準:同時具備下列3項:①符合免疫性血小板減少癥疾病診斷標準;②符合中醫(yī)“脾不統(tǒng)血”中醫(yī)證候辨證標準;③自愿受試,并簽署知情同意書。(5)排除病例標準:具備下列任意1項:①合并嚴重心臟、腦、肝臟、腎臟疾??;②精神病患者;③妊娠、哺乳期婦女;④有嚴重糖尿病、高血壓并發(fā)癥患者;⑤已知對受試藥物或處方中某個單味中藥過敏者。(6)中止和剔除病例標準:符合下列任意1項:①不能堅持治療;②臨床試驗中出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)或嚴重并發(fā)癥;③病情加重,需另行治療。
表1 血小板計數(shù)減少與出血程度分級記分標準
2.研究方法:(1)臨床分組與治療方法:用中國中醫(yī)科學院臨床評價中心設(shè)計的中央隨機系統(tǒng),按隨機抽取的藥物編號將受試者分配到健脾益氣攝血顆粒組(試驗組)、健脾益氣攝血顆粒聯(lián)合潑尼松組(聯(lián)合組)、潑尼松組(西藥組)。健脾益氣攝血配方顆粒(黃芪20g、黨參15g、茯苓15g、白術(shù)10g、阿膠15g、茜草10g、炙甘草6g;北京康仁堂藥業(yè)有限公司),每次1袋,每日2次;潑尼松首次劑量按1.0~1.5mg/(kg·d),早8:00時頓服,治療期間有效減量。健脾益氣攝血聯(lián)合強的松組聯(lián)合使用健脾益氣攝血配方顆粒和潑尼松(用量用法同上)。21天為1個療程。(2) 觀察指標檢測方法:于第1、7、14、21天進行訪視,觀察患者出血程度變化,并采集患者外周血,應(yīng)用全自動血細胞分析儀器檢測外周血象中血小板計數(shù),進行血小板減少程度評分值;于第1、4次訪視點,采集患者外周血,送北京海思特臨床檢驗所,按T淋巴細胞亞群檢測試劑盒說明,流式細胞儀法檢測淋巴細胞及其相關(guān)亞群;以酶聯(lián)免疫競爭抑制法(ELISA)檢測血小板相關(guān)抗體(PAIgG、PAIgA、PAIgM)。
3.統(tǒng)計學方法:同一組治療前后比較若差值符合正態(tài)分布,采用配對t檢驗;若前后差值非正態(tài)分布,采用符號Wilcoxon秩和檢驗。組間比較時,若同時符合正態(tài)分布且方差齊,則采用ANOVA單因素方差分析;若各組均正態(tài)分布但方差不齊,采用Welch檢驗;若非正態(tài)分布,采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。頻數(shù)及構(gòu)成比的檢驗采用χ2檢驗/Fisher確切概率法(當理論頻數(shù)<5的單元數(shù)超過20%時),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
1.一般資料:采用中國中醫(yī)科學院臨床所設(shè)計的中央隨機系統(tǒng),按照臨床試驗方案規(guī)定入選病例標準,自2012年8月~2016年8月,由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院等18家三級甲等中醫(yī)醫(yī)療單位競爭入組ITP患者273例,經(jīng)反復(fù)核對臨床試驗資料,有1例因不符合入選標準而剔除,進入全分析集受試者共272例(試驗組104例,聯(lián)合組103例,西藥組65例)。入組時人口學資料見表2。
表2 3組病例入組時人口學資料
2.出血程度與血小板計數(shù)減少評分值變化:3組病例出血與血小板計數(shù)減少評分值觀察結(jié)果見表3。
表3 3組病例出血程及血小板計數(shù)減少評分值比較分)
與治療前比較,*P<0.05;與試驗組相同時間點比較,#P<0.05;與西藥組相同時間點比較,△P<0.05
從治療第7天開始,試驗組、聯(lián)合組的出血程度評分值較入組時明顯下降,與治療前比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而西藥組從14天開始積分下降。說明西藥組止血效果晚于試驗組、聯(lián)合組。3組病例治療后各訪視點血小板計數(shù)減少程度評分值較治療前有所下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。末次訪視點,聯(lián)合組血小板評分值下降幅度最優(yōu),與試驗組相同時間點比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
3.T淋巴細胞亞群測定值變化:3組病例T淋巴細胞亞群檢入結(jié)果見表4。試驗組CD4+CD25+治療后測定值與治療前比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
4.T淋巴細胞亞群正常和異常比例:3組病例T淋巴細胞亞群正常和異常百分比統(tǒng)計結(jié)果見表5。
表4 3組病例T淋巴細胞亞群測定值比較
與治療前比較,*P<0.05;與試驗組治療后比較,△P<0.05
第4次訪視點聯(lián)合組檢測的CD3+CD4+細胞、CD19+細胞正常和異常例數(shù),與試驗組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
5.血小板相關(guān)抗體變化:3組病例血小板相關(guān)抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM檢測結(jié)果見表6。各組治療前后血小板抗體測定值組內(nèi)或組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
ITP的確切發(fā)病機制目前尚不清晰,目前普遍認為該病為異質(zhì)性免疫性疾病,體液與細胞免疫功能失調(diào)承擔著始動角色。在體液免疫方面,抗體介導(dǎo)的血小板破壞被認為是ITP的經(jīng)典發(fā)病機制,現(xiàn)已證實50%~60%的ITP患者血小板表面可檢測到抗血小板糖蛋白的血小板自身抗體,包括血小板相關(guān)抗體(PAIg)和血小板特異性抗體(PSIg)。這些抗體主要是IgG型,也有IgM、IgA等??贵w與血小板膜抗原結(jié)合后形成抗原抗體復(fù)合物,由單核-吞噬細胞攝取后在脾臟中被破壞。吳意紅等[6]研究發(fā)現(xiàn),歸脾丸不僅能夠提高患者外周血小板計數(shù),亦能降低血小板相關(guān)抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM,總體療效與激素相當。B細胞通常作為抗原遞呈細胞產(chǎn)生抗體,促進CD4+T細胞分化,在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,也可以通過分泌調(diào)節(jié)細胞因子或通過細胞與細胞接觸,直接與病原的T細胞相互作用,從而在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。這類B細胞被稱作調(diào)節(jié)性B細胞[7,8]。細胞免疫異常在ITP發(fā)生、發(fā)展過程中也有重要作用,調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的特殊T細胞亞群。有研究表明,ITP患者存在Treg細胞數(shù)量及功能的異常[9,10],與正常對照比較,ITP 患者尤其是活動性和(或)血小板計數(shù)特別低的患者,外周Treg數(shù)量明顯減少。目前研究較多的是檢測CD4+CD25+Treg細胞,其是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種特殊的專職免疫調(diào)節(jié)細胞,主要通過抑制免疫效應(yīng)細胞增殖、分化及其免疫功能和抑制自然殺傷細胞、細胞毒T細胞等細胞的功能來維持自身免疫平衡。有研究者通過不同實驗方法均得出一致結(jié)論,初診和復(fù)發(fā)的ITP患者體內(nèi)CD4+和CD25+Treg細胞明顯低于正常對照組和緩解期ITP患者,表明ITP患者體內(nèi)可能由于缺乏Treg細胞,從而使自身免疫反應(yīng)不能被有效抑制,導(dǎo)致自身免疫平衡失調(diào)[11]。Arandi等[12]報道,ITP患者CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞數(shù)量明顯減少,功能降低。吳曉勇等[13]建立ITP小鼠動物模型,檢測脾Treg細胞,發(fā)現(xiàn)Treg細胞比例減少、TGF-β1水平降低與ITP的細胞免疫失調(diào)相關(guān)。上述研究充分證明,T、B細胞免疫功能紊亂在ITP發(fā)病機制中占有重要位置。
表5 3組病例T淋巴細胞亞群正常與異常病例數(shù)比較 [n(%)]
與試驗組比較,*P<0.01;治療前后正常/異常應(yīng)等于本組入組病例數(shù),本表治療前后病例數(shù)少于入組病例數(shù)均為該項目檢測的缺失病例數(shù)
表6 3組病例治療前后血小板抗體測定值比較(ng/ml)
本研究從治療第7天開始,試驗組、聯(lián)合組的出血程度評分值較入組時明顯下降,與治療前比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而西藥組從14天開始。說明西藥組止血效果晚于試驗組、聯(lián)合組;3組病例治療后各訪視點血小板計數(shù)減少程度評分值較治療前有所下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。末次訪視點,聯(lián)合組血小板評分值下降幅度最優(yōu),與試驗組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該項研究從臨床角度證明,益氣健脾攝血顆粒對ITP有明確的治療效果。試驗組CD4+CD25+細胞療后測定值與療前比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余各組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明健脾益氣攝血顆粒能夠升高CD4+CD25+細胞,調(diào)節(jié)ITP患者紊亂的免疫機制,維系自身免疫穩(wěn)態(tài)。與試驗組比較,第4次訪視點聯(lián)合組檢測的CD3+CD4+、CD19+正常和異常差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CD3+代表人體細胞免疫功能狀態(tài),CD4+是調(diào)控免疫反應(yīng)最重要樞紐細胞,CD19+則與B細胞免疫相關(guān)。 從上述結(jié)果進一步證實聯(lián)合組不但能夠調(diào)節(jié)T細胞免疫,也可調(diào)控B細胞免疫。各組治療前后血小板抗體測定值組內(nèi)或組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),其研究結(jié)果與何牧卿等[14]、Sakakura等[15]臨床研究結(jié)論相一致。該研究結(jié)果可以說明,調(diào)節(jié)免疫尤其是調(diào)節(jié)T細胞免疫可能是健脾益氣攝血顆粒治療ITP機制之一。但由于治療時間僅21天,尚不能按照ITP療效評定標準判定療效。同時,本研究中T細胞及其亞群以及血小板相關(guān)抗體觀察結(jié)果尚不能提供健脾益氣攝血顆粒具有明確調(diào)節(jié)免疫功能相關(guān)證據(jù),有待于進一步開展臨床或基礎(chǔ)實驗進行彌補或輔助說明。