正交優(yōu)化微波提取補肝散中抗抑郁有效組分群的工藝

王嘉偉，王雪華，彭曉娉，于茲東，由翰林，姜含章，丁文琴，李英霞

（青島大學 藥學院 天然藥物與生藥學系，山東 青島 266021）

補肝散為傳統(tǒng)中藥復方，由香附和夏枯草按2:1組成，具有行氣瀉火、清肝明目的功效，原方主要治療肝郁火盛之癥[1-2]。課題組前期發(fā)現(xiàn)該復方稀醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇分離組份有明顯的抗抑郁活性[3-4]，為復方抗抑郁作用的有效組分。化學定性預試結果表明，乙酸乙酯部位主要含有黃酮類等成分，正丁醇部位主要含有三萜皂苷類等成分。目前，對補肝散提取工藝的研究尚未見文獻報道。本文采用微波提取新技術，以總黃酮和總皂苷為考察指標，對影響補肝散醇提工藝參數(shù)進行正交實驗優(yōu)選，并與超聲法和回流法進行了比較，旨為今后進一步分離、純化抗抑郁有效組分奠定前期基礎。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑、試藥

夏枯草飲片及香附飲片均購于青島市健聯(lián)藥店，批號分別為160701和160601，前者產(chǎn)于河南，后者產(chǎn)于浙江，經(jīng)青島大學藥學院生藥學教研室李英霞教授鑒定，分別來源于唇形科植物夏枯草（Prunella vulgarisL.）的干燥果穗和莎草科植物莎草（Cyperus rotundusL.）的干燥根莖。

蘆丁對照品和熊果酸對照品（二者純度均≥98 %），購自成都德瑞可生物科技有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；MAS-Ⅱ微波提取儀（上海新儀微波化學科技有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHK-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵（鄭州科泰實驗設備有限公司）；NVP-1000隔膜真空泵（上海埃朗儀器有限公司）；DK-S22電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；Centrifuge 5424高速離心機（德國Eppendorf）；SHZ-DIII型不銹鋼循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；EYELA冷卻水循環(huán)裝置（上海愛朗儀器有限公司）；AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-100DB數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）

2 實驗方法

2.1 樣品溶液的制備

稱取補肝散粉末（40～60目）3 g，置100 ml提取瓶，加入一定質(zhì)量分數(shù)的乙醇60 ml，設定一定功率、輻射溫度和時間進行微波提取。提取完畢，放冷，離心（3500 r/min），將上清轉(zhuǎn)入100 ml量瓶，加一定體積分數(shù)的乙醇，定容至刻度，混勻，作為供試品溶液 。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 標準曲線的繪制 精密吸取干燥至恒重的蘆丁對照品適量，加甲醇溶解，配成濃度為0.102 mg/ml對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.2，0.5，1，2，3，4，6，8 ml，分別置入10 ml量瓶，分別加5 %亞硝酸鈉溶液（NaNO2）0.3 ml,搖勻，靜置6 min，加10 %硝酸鋁溶液0.3 ml，搖勻，靜置6 min，加4 %氫氧化鈉溶液4 ml，加甲醇至刻度，搖勻，放置12 min，以上述顯色劑同樣操作，制備空白對照，用紫外-可見分光光度計于501 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，計算回歸方程為Y=0.01105X-0.0150 （r=0.9994），表明蘆丁在0.0204～0.8160 mg內(nèi)線性關系良好。

2.2.2 樣品溶液含量測定 精密量取不同供試品溶液2 ml，置入10 ml量瓶，分別按2.2.1項下方法加入顯色劑，測定提取液中總黃酮的含量。

2.3 總皂苷含量測定

2.3.1 標準曲線的繪制 精密稱取熊果酸標準品適量，加甲醇溶解配成濃度為0.11 mg/ml的對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.2，0.4，0.5，0.6，0.7，1 ml置離心管中，蒸去溶劑后，加5 %香草醛冰醋酸溶液0.3 ml，濃硫酸1 ml，80 ℃水浴加熱10 min，立即置冰浴中，冷卻5 min，加冰醋酸5 ml，搖勻，以上述顯色劑同樣操作，制備空白對照采用紫外-可見分光光度計于547 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，計算回歸方程為Y=0.0458X-0.0401（r=0.9990），表明熊果酸在0.022～0.110 mg內(nèi)線性關系良好。

2.3.2 樣品溶液含量測定 精密量取不同供試品溶液2 ml，置入25 ml量瓶，加相應體積分數(shù)的乙醇，定容至刻度，取1 ml按2.3.1項下方法操作，測定提取液中總皂苷的含量。

2.3.3 總黃酮或總皂苷提取率=（提取液中總黃酮含量或總皂苷含量×提取液體積×稀釋倍數(shù)）／補肝散質(zhì)量×100 %。

2.4 單因素試驗

2.4.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮和總皂苷提取率的影響 取補肝散粉末6份，每份6 g，分別加10 %，30 %，50 %，70 %，80 %和95 %乙醇60 ml，微波提取，固定微波功率600 W，提取時間10 min，輻射溫度60 ℃，料液比1:10。提取完畢，放冷，離心，取上清按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2項下方法操作，測定總黃酮和總皂苷的含量及提取率。

2.4.2 提取時間對總黃酮和總皂苷提取率的影響取補肝散粉末5份，每份6 g，分別加50 %乙醇60 ml，微波提取5，10，15，20，30 min固定微波功率600 W，提取溫度60 ℃，料液比1:10。提取完畢，放冷，離心，取上清按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2項下方法操作，測定總黃酮和總皂苷的含量及提取率。

2.4.3 提取溫度對總黃酮和總皂苷提取率的影響 分別取補肝散粉末5份，每份6 g，分別加50 %乙醇60 ml，于40，50，60，70，80 ℃微波提取，固定提取功率600 W，提取時間15 min，料液比1:10。提取完畢，放冷，取上清液按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2項下方法操作，測定總黃酮和總皂苷的含量及提取率。

2.4.4 微波功率對總黃酮和總皂苷提取率的影響 分別取樣品6份，每份6 g，分別加50 %乙醇60 ml，微波提取，分別設定功率200，300，400，500，600和700 W，固定提取時間15 min，溫度60 ℃，料液比1:10。提取完畢，放冷，離心，取上清液按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2項下方法操作，測定總黃酮和總皂苷的含量及提取率。

2.4.5 料液比對總黃酮和總皂苷提取率的影響 分別取補肝散粉末4份，每份4.5 g，分別在提取瓶中加入料液比（g:ml）為8，10，15，20倍50 %乙醇微波提取，固定微波提取功率600 W，時間15 min，溫度60 ℃。提取完畢，放冷，離心，取上清液按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2項下方法操作，測定總黃酮和總皂苷的含量及提取率。

2.5 正交試驗

在單因素考察的基礎上，固定料液比1:20，選取乙醇體積分數(shù)（A）、輻射溫度（B）、微波功率（C）及提取時間（D）為試驗因素，每個因素設計3個水平，選擇L9（34）正交表（見表1）進行試驗，并進行方差分析。

表1 因素水平表

2.6 驗證性實驗

按照正交實驗優(yōu)選出的工藝條件微波提取補肝散。另外采用超聲法和傳統(tǒng)回流法提取，超聲提取條件與微波提取相同，回流法提取時間為2 h，其他條件與微波法一致，提取完畢，按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2項下方法操作，測定總黃酮和總皂苷的含量及提取率。

3 結果與分析

3.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮和總皂苷提取率的影響

結果見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮和總皂苷提取率的影響

由圖1可見，乙醇體積分數(shù)從10 %升高至 50 %，總黃酮和總皂苷的提取率也隨之提高。對于總黃酮，以50 %乙醇提取最高（2.160 %），而后提取率逐漸下降；對于總皂苷，以70 %乙醇提取的為最高（0.984 %），其次是50 %乙醇提取的（0.803 %），二者相差不大，綜合考慮，初步選擇以50 %提取。

3.2 輻射時間對總黃酮和總皂苷提取率的影響

結果見圖2。

由圖2可見，隨提取時間延長（5 min至15 min），總黃酮和總皂苷的提取率均逐漸提高。對于總黃酮提取率，20 min為最高（2.957 %），30min略有下降；對于總皂苷提取率，15 min提取率最高（0.895 %），20 min至30 min，提取率有所下降，考慮15～20 min提取已完全，繼續(xù)延長提取時間，皂苷類成分的結構可能會發(fā)生變化，綜合考慮確定提取時間為15 min。

圖2 輻射時間對總黃酮和總皂苷提取率的影響

3.3 輻射溫度對總黃酮和總皂苷提取率的影響

結果見圖3。

圖3 輻射溫度對總黃酮和總皂苷提取率的影響

由圖3可見，提取溫度升高，總黃酮和總皂苷的提取率也隨之提高，至80 ℃提取率最高，再升高溫度，藥液易產(chǎn)生爆沸，故確定提取溫度為80 ℃。

3.4 料液比對總黃酮和總皂苷提取率的影響

結果見圖4。

由圖4可見，隨料液比的增大，總黃酮和總皂苷的提取率也逐漸提高，1:20為最高，故確定料液比為1:20。

3.5 微波功率對總黃酮和總皂苷提取率的影響

結果圖5。

圖4 料液比對總黃酮和總皂苷提取率的影響

圖5 微波功率對總黃酮和總皂苷提取率的影響

由圖5可見，微波功率從200 W升至700 W，總黃酮和總皂苷的提取率變化不明顯。200 W總黃酮提取率略高，400 W總皂苷提取率略高，從能耗角度考慮，初步確定微波功率選擇200 W。

3.6 正交試驗結果

結果見表2 、表3。

由表2、表3直觀分析和方差分析結果可見，A、B和D因素均為影響總黃酮提取率的顯著性因素，C因素為次要因素；B因素為影響總皂苷提取率的顯著性因素，其它因素為次要因素。對于B因素，溫度升高，總黃酮和總皂苷的提取率也提高，故選擇水平3，即輻射溫度80 ℃；對于D因素，提取時間延長，總黃酮和總皂苷提取率也提高，故選擇水平3，即提取時間15 min；A因素對總黃酮提取率的影響情況為：水平2（50 %乙醇）＞水平3（70 %乙醇）＞水平1（30 %乙醇），而對總皂苷提取率則為水平3＞水平2＞水平1，因A因素為總黃酮的顯著性因素，綜合考慮，選擇水平2，即乙醇體積分數(shù)為50 %；對于C因素，總黃酮的提取率含量以水平1（200 W）的略高，而總皂苷提取率為水平2（400 W）＞水平1（200 W）＞水平3（600 W），因C因素為次要因素，綜合考慮能耗等情況，確定微波功率為200 W。

根據(jù)以上試驗結果，確定微波提取補肝散中總黃酮和總皂苷的最優(yōu)工藝為乙醇體積分數(shù)50 %，輻射溫度80 ℃，微波功率200 W，提取時間15 min。

表2 L9（34）試驗方案及結果分析表

3.7 驗證性試驗結果

稱取3批補肝散，按上述2.1， 2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2項下方法操作，測定其提取液中總黃酮和總皂苷的含量及提取率。 結果其總黃酮提取率分別為3.250 %，3.191 %和3.303 %，平均3.248 %，RSD為1.72 %；總皂苷提取率分別為1.547 %，1.558 %和1.591 %，平均1.565 %，RSD為1.46 %，均高于正交試驗中的結果，說明優(yōu)選出的工藝可行，穩(wěn)定性良好。

表3 方差分析表

4 討論與小結

微波提取具有提取時間短、效率高、能耗低、環(huán)保等優(yōu)點，是一種新型的提取方法，近年在中藥及天然藥物的提取中得到愈來愈廣泛的應用[5-10]。本文采用單因素考察與正交試驗相結合的方法，對微波提取補肝散中總黃酮和總皂苷工藝進行了優(yōu)選，確定的最佳工藝參數(shù)為：體積分數(shù)為50 %的乙醇，料液比1:20，微波功率200 W，提取溫度80 ℃，提取時間15 min，驗證試驗結果穩(wěn)定、可靠，可用于補肝散中黃酮類和皂苷類成分的提取。