奧硝唑聯(lián)合小檗堿對牙周致病菌的體外抗菌活性試驗

王希 賴筱姮 林菁

牙周炎主要是由牙菌斑中的致病微生物感染引起牙周支持組織損傷，牙周支持組織的破壞是造成患者牙齒脫落的重要原因。而牙菌斑中的厭氧菌是一大類致病因素。牙周炎治療主要通過控制牙周致病菌的情況，維持口腔正常菌群平衡[1]。奧硝唑（Ornidazole，ORN）屬于硝基咪唑類衍生物新型抗厭氧菌藥物，局部治療效果好，藥物持續(xù)時間長，廣泛運用于厭氧菌感染引起的各類口腔疾病治療[2-4]。小檗堿（Berberine，BER）抗菌譜廣，體外能對抗多種病原微生物，口腔局部給藥安全便利，耐藥程度低，不良刺激小等優(yōu)點[5-6]。此外，小檗堿還可抑制牙周致病菌的膠原酶活性，因而是否可以將小檗堿與奧硝唑進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，目前還未見到這方面研究的報道[7]。通過兩藥聯(lián)合使用，對牙周炎進(jìn)行局部治療，可以提高有效藥物濃度，降低使用量，提高臨床治療效果，減低臨床耐藥的發(fā)生，促進(jìn)人體免疫能力，并作為新的處方配伍。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌與藥物

細(xì)菌選用本實驗室保存的國際標(biāo)準(zhǔn)菌株牙齦卟啉單胞菌（P.g，ATCC33277）、伴放線放線桿菌（A.a，ATCC29523）、具核梭桿菌（F.n，A T C C 2 5 5 8 6)， 黏性放線菌(A.v，ATCC27044)，變形鏈球菌（S.m，ATCC25175）。奧硝唑（上海麥克林生化科技有限公司，CAS號：16773-42-5，批號C10051407），鹽酸小檗堿（東北制藥集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H21020425，批號0361506045），腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion Broth，BHI）（英國OXOID，批號1872340），聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）（阿拉丁試劑有限公司，批號F1607098）。

1.2 藥物配制

雙蒸水溶法配置配制成一種濃度為10 mg/ml的奧硝唑無菌貯存液。使用聚乙二醇制成濃度為20 mg/mL的小檗堿貯存液，4 ℃保存。用同樣BHI液體實驗前進(jìn)行梯度稀釋。

1.3 微量液體稀釋法

用BHI液體培養(yǎng)基按梯度稀釋法將奧硝唑（Ornidazole，ORN）、鹽酸小檗堿（Berberine，BER）分別稀釋，濃度為5.12～0.005 mg/mL的溶液。96 孔板中加入100 μL的上述ORN梯度稀釋液，同時每孔加入100 μL的菌懸液，最終接種菌濃度為1×106CFU/mL，ORN藥物溶液的最終濃度為2.56～0.002 5 mg/mL。同時設(shè)置陰性及陽性對照孔，設(shè)4個復(fù)孔。振蕩后常規(guī)厭氧恒溫培養(yǎng)48 小時后觀察結(jié)果（ 黏性放線菌、變形鏈球菌孵育24 h）。小檗堿、聚乙二醇操作同奧硝唑。最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為經(jīng)肉眼查看無菌生長的最低藥物濃度。

1.4 微量棋盤稀釋法

將ORN與BER儲備液用BHI進(jìn)行倍比稀釋，使藥物終濃度為單獨作用時MIC值的1/16～2倍。采用棋盤稀釋法，將不同濃度比例的兩種藥物（各50 μL）及100 μL 的菌懸液加入96孔板中，終濃度為1×106CFU/mL。同時分別進(jìn)行生長、空白對照。培養(yǎng)條件同1.3（變形鏈球菌、黏性放線菌孵育24 h）。采用分級抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）判斷聯(lián)合藥敏實驗。

2 結(jié)果

2.1 ORN與BER對牙周炎常見致病菌MIC

微量液體稀釋試驗結(jié)果表明牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌、具核梭桿菌對ORN和BER的敏感性較高，其中具核梭桿菌MIC分別為0.000 078 mg/mL、0.01 mg/mL，其敏感性最高；變形鏈球菌對ORN的敏感性較BER低，兩藥的MIC分別為5.12 mg/mL和0.04 mg/mL； 伴放線放線桿菌對ORN的敏感性較BER高，兩藥的MIC分別為0.64 mg/mL和1.28 mg/mL（表1）。

2.2 ORN與BER聯(lián)合藥敏試驗

ORN與BER聯(lián)合藥敏試驗的結(jié)果見表2～5。并以FIC值判斷兩藥聯(lián)用效果。1/8 ～1/4 MIC BER聯(lián)合1/4 MIC ORN，F(xiàn)IC值 ≤0.5，兩者對P.g 為協(xié)同抑菌效果，其中1/4 MIC ORN和1/8 MIC BER濃度聯(lián)用時，F(xiàn)IC值最小，對 P.g 協(xié)同抑菌效果最好。1/16～1/4 MIC BER聯(lián)合1/4 MIC ORN，F(xiàn)IC ≤0.5，兩者對A.a 抑菌效果表現(xiàn)為協(xié)同作用，其中當(dāng)1/4 MIC ORN聯(lián)合1/16 MIC BER時，F(xiàn)IC值最小，兩者對A.a協(xié)同抑菌效果最好。 BER聯(lián)合 ORN，0.5＜FIC≤1，兩者對F.n 為相加抑菌效果。C BER聯(lián)合 ORN，其1＜FIC≤2，兩藥聯(lián)用對A.v 為無關(guān)作用。

表1 ORN、BER 對牙周炎致病菌MIC（mg/mL，n=3）

表2 ORN 與BER 對P.g 聯(lián)合用藥結(jié)果

表3 ORN 與BER 對F.n 聯(lián)合用藥結(jié)果

表4 ORN 與BER 對A.a 聯(lián)合用藥結(jié)果

表5 ORN 與BER 對A.v 聯(lián)合用藥結(jié)果

3 討論

結(jié)果表明P.g、F.n等病菌在牙周炎病變嚴(yán)重部位其檢出率增高明顯，其代謝產(chǎn)物能加速牙周組織的破壞。A.a產(chǎn)生的多種細(xì)胞毒素可造成牙周細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而引發(fā)侵襲性牙周炎。S.m產(chǎn)生的脂肪酸和細(xì)胞壁成分均可引起牙周組織損傷、誘導(dǎo)骨吸收。A.v還可促進(jìn)破骨細(xì)胞的炎癥釋放。綜上考慮以上致病菌對牙周炎的發(fā)生發(fā)展有著重要的作用[8-10]。

奧硝唑，具有較強(qiáng)的抗厭氧菌作用，用藥時，牙周病患者的牙周細(xì)菌清除效率高，半衰期較長，副作用較少[11-12]。然而，長期單獨使用奧硝唑療效有限，牙周炎癥不能明顯消除，患者的牙周深袋、探診出血等癥狀仍未得到改善。有實驗表明小檗堿具有抗菌增效作用，并可能通過直接和間接的作用對牙周炎的控制起作用[13]。

本實驗結(jié)果顯示，具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌對奧硝唑和小檗堿敏感性較高，其中以具核梭桿菌最為敏感，同時兩藥聯(lián)用對牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌具有協(xié)同抑菌效果，對具核梭桿菌抑菌效果表現(xiàn)為相加作用；兼性厭氧變形鏈球菌對小檗堿敏感性高，而對奧硝唑的敏感性低、兩藥聯(lián)用時可產(chǎn)生互補(bǔ)作用。而黏性放線菌對奧硝唑敏感、對小檗堿敏感性較低。

通過兩種藥物對牙周炎主要致病菌的研究結(jié)果，可以將奧硝唑和小檗堿聯(lián)合使用，治療牙周炎混合感染的病例，其聯(lián)合治療的可行性高，可作為本課題組下一步的口腔抗菌膜劑的處方并對處方進(jìn)行篩選和優(yōu)化，既可以降低藥物使用量，又可以預(yù)防細(xì)菌抗藥性的發(fā)生，使得兩種藥物都能在臨床上發(fā)揮更多更好的效果，確實達(dá)到老藥新用的目的。