肝腫瘤細胞干性與糖代謝特點的相關性研究

李懿皞，戴 謙，王蓓麗，潘柏申，郭 瑋

復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032

近年來，腫瘤的發(fā)病率和死亡率都在不斷地增長。有研究報道，腫瘤相關死亡人數目前已占到了我國全年總死亡人數的25%［1］。肝癌，包括肝細胞肝癌和肝內膽管癌，有著遷延不愈、晚期患者預后大多不良的特點，其發(fā)病率在國內所有的腫瘤性疾病中位列第四，而其死亡率則位列第三位；在世界范圍內，肝細胞肝癌的發(fā)病率和死亡率也位居前列［2］。20世紀20年代，Otto Warburg首次觀察到腫瘤細胞即使在有氧條件下，其糖代謝過程也會更傾向于糖酵解方向。因此，腫瘤中這種糖代謝重組特點也被稱為“溫伯格效應”［3］，該特點在2011年被歸納入腫瘤的10大特征［4］。近年來的研究在不斷解明溫伯格效應產生的具體機制的同時，也發(fā)現(xiàn)了腫瘤中這種代謝特點可能與疾病的預后、腫瘤的惡性程度或其大小相關［5］；但也有研究者認為，在腫瘤組織中，并不是所有的腫瘤細胞都像研究中已報道的那樣執(zhí)行糖酵解模式，而是分成了溫伯格型細胞和氧化磷酸化型細胞兩類腫瘤細胞［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的遷延不愈是由于存在具有自我更新和多向分化能力的腫瘤干細胞，這類細胞被認為是腫瘤術后復發(fā)和轉移的最主要因素［7-8］。迄今為止，很少有研究指明腫瘤干細胞是否也存在糖代謝上的改變。本研究旨在通過對比腫瘤干細胞與一般腫瘤細胞的代謝特點，探究腫瘤細胞的干性與其糖代謝特征的關聯(lián)。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

1.1.1 研究對象

人肝腫瘤細胞系Huh-7、人肝細胞系LO2均購自中國科學院典藏培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，人肝腫瘤細胞系MHCC97H為復旦大學附屬中山醫(yī)院保存細胞系。

1.1.2 實驗試劑

實驗所用培養(yǎng)體系中DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12混合培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，DMEM低糖培養(yǎng)基購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，無血清懸浮培養(yǎng)添加細胞因子B27、bFGF、HGF及EGF也均購自美國Gibco公司，6孔細胞培養(yǎng)板、超低黏附6孔細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司，流式細胞術分選所用抗體BV421-EpCAM、PE-CD133、APCCD90均購自美國BD公司。

RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒均購自QIAGEN公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）引物由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成，反應體系為寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司的TB GreenTMPremix Ex TaqTM，相關引物序列見表1［9-17］，RTFQPCR反應條件見表2。蛋白質印跡法（Western blot）檢測抗體兔抗人HexokinasesⅡ抗體、兔抗人GLUT1抗體、兔抗人PKM2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗人LDH-A抗體購自美國Abcam公司，鼠抗人β-actin抗體購自美國Intech公司，葡萄糖類似物2-NBDG購自美國Life Technology公司。生成的乳酸含量用美國強生VITROS 5600全自動生化免疫分析儀進行檢測。

表1 腫瘤干性標志物和糖代謝酶相關基因名稱、引物序列Tab.1 Cancer stem cell markers and glycolysis-related enzyme genes’names and primer sequences

表2 RTFQ-PCR反應條件Tab.2 Reaction conditions of RTFQ-PCR

1.2 方法

1.2.1 干細胞流式分選和培養(yǎng)

對肝癌細胞系Huh-7、MHCC97H的干細胞標志物（EpCAM、CD90、CD133）進行標記，用BD FACS AriaⅡ流式細胞分選儀分選干性標志物陽性的細胞，對其計數后進行無血清DMEM/F12培養(yǎng)基（含2%生長因子B27、20 ng/mL的bFGF、10 ng/mL的HGF及20 ng/mL的EGF）懸浮培養(yǎng)，干性標志物陰性的細胞作為對照組細胞用同樣的方式進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、CO2體積分數為5%的環(huán)境中，每2天根據培養(yǎng)情況更換或補充培養(yǎng)基。

1.2.2 RTFQ-PCR和Western blot檢測

培養(yǎng)完成后提取RNA，逆轉錄后運用RTFQPCR以β-actin為內參，對成球細胞和對照組細胞的干性標志物、糖代謝酶相關基因表達進行相對定量［9-17］。提取蛋白變性后在10%SDS-PAGE中以β-actin為內參，對糖代謝酶蛋白表達量進行電泳檢測。

1.2.3 細胞葡萄糖攝取實驗

細胞分選、計數成球培養(yǎng)后，分別取5×104個Huh-7、MHCC97H的成球和非成球細胞混合，用低糖型無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓處理后加入濃度為150 μmol/L的2-NBDG溫育，用DAPI染色后在熒光顯微鏡的FITC/DAPI通道下鏡檢拍照，并用BD FACS AriaⅡ流式細胞分選儀對其細胞內FITC通道的平均熒光強度進行檢測和計算［18-19］。

1.2.4 細胞乳酸生成實驗

細胞分選、成球培養(yǎng)后，分別取4×103個Huh-7、MHCC97H的成球和非成球細胞接種入24孔細胞培養(yǎng)板上1 mL的高糖型DMEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)4 h后，對其培養(yǎng)上清液中乳酸的生成量進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用Microsoft Office Excel 2013、IBM SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用GraphPad Prism 6.0軟件進行相關圖像的繪制。RTFQ-PCR結果采用2-ΔΔCq法［ΔΔCq=ΔCq（target cell）-ΔCq（control group cell），ΔCq=Cq（target）-Cq（β-actin）］進行處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝腫瘤干細胞具有較強的成球能力

采用流式細胞術分選干性標志物（CD90、CD133、EpCAM）dim區(qū)和pos區(qū)的細胞（圖1A為分選的huh7干性標志物陽性細胞，圖1B為分選的MHCC97H干性標志物陽性的細胞）并進行無血清懸浮培養(yǎng)10 d后，在倒置顯微鏡下觀察可見相比干性標志物陰性的細胞，干性標志物陽性細胞已成明顯的球狀（圖1C）。分別對成球細胞和非成球的干性標志物進行RTFQ-PCR驗證，結果顯示，成球細胞的干性標志物的表達較非成球細胞更顯著（圖1D，P＜0.05）。這一結果表明，相比不表達干性標志物的肝腫瘤細胞，表達干性標志物的腫瘤細胞在無血清懸浮培養(yǎng)環(huán)境中能夠成球，這一培養(yǎng)模式能作為富集腫瘤干細胞的手段。

2.2 腫瘤干細胞具有較強的糖酵解代謝酶表達

以人肝細胞系LO2為對照、β-actin為內參，對成球、非成球腫瘤細胞丙酮酸激酶同工酶M2（pyruvate kinase isozyme M2，PKM2）、葡萄糖轉運蛋白1（glucose transporter 1，GLUT-1）、乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDH-A）、己糖激酶2（hexokinase Ⅱ，HK-Ⅱ）等糖酵解關鍵酶的表達情況分別通過RTFQ-PCR和Western blot進行了驗證（圖2）。GLUT-1、PKM2和LDH-A等糖酵解關鍵酶在肝腫瘤細胞系中的表達較正常肝細胞均有顯著的升高（圖2A，P＜0.05），而其在成球細胞中的表達較非成球細胞則有更進一步地升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在蛋白水平上，相比非成球細胞，成球細胞LDH-A、PKM2、HK2及GLUT-1的表達也有顯著的提升。該結果表明，腫瘤干細胞的糖酵解相關酶的表達量相比非成球的腫瘤細胞更高，提示腫瘤干細胞所含有的糖酵解酶含量更豐富，腫瘤干細胞的代謝向糖酵解轉變的程度更高（圖2B）。

圖1 干性標志物陽性的肝腫瘤細胞具有成球能力Fig.1 HCC cells with positive cancer stem cell markers could shape spheroids

圖2 成球與非成球細胞糖酵解酶/蛋白表達情況圖Fig.2 Comparison of glycolysis enzymes and proteins between spheroid and non-spheroid cells

2.3 腫瘤干細胞具有較強的葡萄糖攝取能力

本實驗中采用了2-NBDG對成球及非成球細胞在同一葡萄糖供應體系下對葡萄糖的攝取能力進行了對比。圖3A為MHCC97H細胞組、Huh-7細胞組的2-NBDG攝取結果圖，圖中綠色熒光為被細胞攝取后的2-NBDG；藍色熒光為DAPI染色后的細胞核成分。在熒光顯微鏡下可見，在同一葡萄糖供應體系下成球細胞有著對葡萄糖明顯更多的攝取，表明腫瘤干細胞的葡萄糖攝取能力顯著強于非干性腫瘤細胞。

將攝取了2-NBDG的成球與非成球Huh-7細胞，采用流式細胞術檢測其熒光強度，結果顯示，其平均熒光強度也存在著顯著的差異?；疑珵槲磾z取2-NBDG的背景熒光，紫色為攝取2-NBDG后的非成球細胞，藍色為攝取2-NBDG后的成球細胞，成球腫瘤細胞的平均熒光強度明顯高于非成球的腫瘤細胞的平均熒光強度（成球組平均熒光強度為17 637，非成球組平均熒光強度為12 567，P＜0.05），這也說明成球細胞對葡萄糖的攝取能力明顯高于非成球細胞（圖3B）。

2.4 腫瘤干細胞具有較強的乳酸生成能力

本實驗通過對定量的成球和非成球細胞在含有等量葡萄糖的等量培養(yǎng)基中產生的乳酸情況進行了對比。在相同條件下，成球腫瘤細胞培養(yǎng)后產生并排至細胞上清液中的糖酵解終產物——乳酸的量較非成球細胞更多。本研究中成球腫瘤細胞不僅葡萄糖攝取能力高，成球腫瘤細胞的糖酵解能力也明顯強于非成球細胞（表3）。

圖3 成球與非成球細胞葡萄糖攝取能力結果圖Fig.3 Comparison of glucose uptake ability between spheroid and non-spheroid cells

表3 成球與非成球細胞乳酸生成能力對比Tab.3 Comparison of lactic acid production ability between spheroid and non-spheroid cells

3 討 論

近年來，腫瘤的發(fā)病率和死亡率都呈逐年上升的趨勢，在我國，肝癌一直以來都是威脅人們健康的一個重大問題，2015年因肝癌死亡的患者就達到了422 100例。雖然目前針對肝細胞肝癌的治療手段有外科手術、介入手術等，但這類患者很多仍難以逃過術后疾病復發(fā)、腫瘤遷延不愈的問題。

腫瘤干細胞有著和正常干細胞一樣的自我更新、多能分化的特點。腫瘤干細胞的這一特點也被認為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移以及抗癌藥物耐藥性的產生有著千絲萬縷的聯(lián)系。為了能發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞的存在，近年來建立了許多富集腫瘤干細胞的方法，包括陽選法、陰選法、無血清懸浮培養(yǎng)等。其中，陽選法的思路也被用于循環(huán)腫瘤細胞的富集中。另外，研究也發(fā)現(xiàn)了許多腫瘤的干性標志物，包括CD90、EpCAM、CD133和CD24［9-12］等。而由于腫瘤細胞存在異質性，僅運用單一的腫瘤細胞表面標志物可能產生漏檢的情況。無血清懸浮培養(yǎng)技術是一種較為經濟實用的富集手段［20］，本研究也將陽選法和無血清懸浮培養(yǎng)法用于肝癌干細胞的富集中。

另一方面，腫瘤細胞的代謝也是近年來學者們關注的焦點之一。腫瘤細胞的溫伯格效應，或稱“有氧糖酵解”現(xiàn)象就是腫瘤代謝重組的一個重要的特點。眾所周知，腫瘤細胞的生長需要大量的ATP，而有氧糖酵解相比氧化磷酸化，其產能水平和效率都遠為低下。目前的研究也發(fā)現(xiàn)，為了彌補這種產能效率的不足，腫瘤細胞往往都傾向于提升其對葡萄糖的攝取、提升其糖酵解酶的作用以及增加代謝副產物的排泌等，最典型的改變就表現(xiàn)在腫瘤細胞糖酵解相關酶/蛋白的表達量、功能的提升上，如GLUT-1、HK-Ⅱ、PKM2和LDH-A等。目前的研究中也有學者證實，腫瘤細胞“有氧糖酵解”的代謝重組現(xiàn)象也與某些癌基因（如ras、myc等）及相關信號通路的激活和（或）抑癌基因［21-22］（如p53等）的失活以及腫瘤相關信號轉導蛋白的表達增加（如HIF-1α等）［23］有關，而這些基因的改變也能影響腫瘤細胞的增殖能力。

本研究首先根據先前的研究［9-12,24］，根據CD133、CD90和EpCAM等干性標志物的表達情況對Huh-7和MHCC97H細胞進行分選后培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，干性標志物高表達的腫瘤細胞能在無血清懸浮培養(yǎng)的環(huán)境中成球；對這兩種細胞的干性標志物進行轉錄本水平的分析表明，成球細胞的干性標志物較非成球細胞的表達有著顯著的提升。由此可見，腫瘤干細胞有著能在無血清懸浮培養(yǎng)的環(huán)境中成球的特點，這一培養(yǎng)條件能作為富集腫瘤干細胞的手段。

本研究以永生的人肝細胞系LO2為對照，對成球細胞和非成球細胞糖酵解酶的mRNA和蛋白表達進行了檢測。結果顯示，除了HK-Ⅱ，相比正常肝細胞系LO2，肝癌細胞系Huh-7和MHCC97H的糖酵解酶mRNA表達更高，而成球細胞的糖酵解酶mRNA表達顯著高于非成球細胞。在蛋白水平上，成球Huh-7細胞的LDH-A、PKM2、HK-Ⅱ和GLUT-1的表達均顯著高于非成球Huh-7細胞，也均高于LO2細胞；而成球的MHCC97H細胞也有類似的表現(xiàn)（GLUT-1除外）。這提示我們，相比非成球腫瘤細胞及正常肝細胞，成球腫瘤細胞的糖酵解酶的轉錄和表達更豐富。在熒光顯微鏡下對比成球細胞與非成球細胞在同一葡萄糖供應體系中對葡萄糖類似物2-NBDG的攝取可見，成球細胞攝取的2-NBDG的熒光相比非成球細胞中更為明亮和豐富，提示成球細胞對葡萄糖的攝取能力遠高于非成球細胞，流式細胞術的檢測結果也證實了這一點；同時，在相同培養(yǎng)條件下，成球細胞的乳酸生成量遠高于非成球細胞，表明干性表達的成球細胞的糖代謝重構程度遠高于非干性的非成球細胞，腫瘤干細胞對葡萄糖的攝取和利用能力更強，糖酵解通路更活躍，結果提示腫瘤糖代謝重構的程度和腫瘤細胞的干性表達存在相關性。

綜上所述，本研究結果表明，無血清懸浮培養(yǎng)是一種可用來富集肝腫瘤干細胞的體外培養(yǎng)方式；此外我們也觀察到肝腫瘤干細胞的糖酵解活躍程度高于非干性的腫瘤細胞。