魏玲 楊國(guó)淋 王懷禹 李彩虹
(1,南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院 63700 ;2,川北醫(yī)學(xué)院 637000)
細(xì)小病毒病是寵物醫(yī)院臨床上常見(jiàn)的犬疾病,在感染該病后主要導(dǎo)致狗出現(xiàn)急性出血性腸炎和心肌炎,是一種高度傳染性的疾病,發(fā)病率高,死亡率高達(dá)60%,是最具威脅性的疾病之一[1]。目前,隨著生物技術(shù)的發(fā)展,可以從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步了解CPV 的功能結(jié)構(gòu),為CPV 病毒的真核或原核表達(dá)策略提供參考資料。此外,為CPV 膠體金快速診斷條帶基因工程疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。為進(jìn)一步了解和探索犬細(xì)小病毒的生長(zhǎng)特性和增殖規(guī)律,為本病防治提供理論依據(jù)。
先通過(guò)登陸NCBI 網(wǎng)站,查詢VP2 基因的DNA 序列,然后采用分子生物學(xué)軟件對(duì)VP2 的蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析,主要使用VP2An-the-2000 來(lái)完成;通過(guò)ProtScale 軟件對(duì)VP2 基因的疏水性進(jìn)行分析;通過(guò)http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi 完成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析;通過(guò)http://emboss.bioinformatics.nl 完成蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析;采用NetPhos 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/Net.Phos)分析CPV-VP2蛋白存在磷酸化位點(diǎn),經(jīng)NetNGlyc1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGbc)分析CPV-VP2蛋白存在的糖基化位點(diǎn),采用Bcepred ( http://www.imtech.res.in/raghava/bce -pred/bcepred_submission.html) 分析CPV-VP2蛋白存在的B 細(xì)胞抗原表位。
從NCBI 網(wǎng)站的核苷酸模塊中可以找到CPV-VP2 基因的全長(zhǎng)DNA 序列,該基因的登錄號(hào)為KF803643。CPV 的VP2 DNA總長(zhǎng)度為1755bp,其編碼氨基酸個(gè)數(shù)為584。經(jīng)過(guò)采用ProtParam 程序來(lái)預(yù)測(cè)VP2 基因氨基酸序列的基本特性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度為1g/L 時(shí),結(jié)合半胱氨酸不形成二硫鍵的條件下,其光的吸收數(shù)值(Abs)為1.703,蛋白的不穩(wěn)定數(shù)值為28.91(<40.00),此數(shù)據(jù)顯示了該基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。
CPV-VP2蛋白的最高親水值為-2.467,最高疏水值為2.178。通常,親水性氨基酸比疏水性氨基酸更均勻地分布,并且整條蛋白鏈呈現(xiàn)出親水性的特點(diǎn)。通過(guò)在線平臺(tái)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CPV-VP2 沒(méi)有表達(dá)出蛋白的相關(guān)信息,且原核表達(dá)與編碼序列有著緊密聯(lián)系。本次研究發(fā)現(xiàn),CPV-VP2蛋白屬于親水性,而且其氨基酸無(wú)顯著的跨膜現(xiàn)象,這一現(xiàn)象與疏水性相關(guān)分析有相似之處。
通過(guò)Phyre2 蛋白預(yù)測(cè)程序預(yù)測(cè)氨基酸序列的二維結(jié)構(gòu)。其中,α-螺旋區(qū)有58 個(gè)氨基酸,占9.05%,非常小。β 折疊區(qū)有143 個(gè)氨基酸,占25.77%,相對(duì)較大。不規(guī)則卷曲區(qū)域有383個(gè)氨基酸,占66.19%,占很大比例。
通過(guò)同源建模檢測(cè)CPV-VP2 相關(guān)理論的維度結(jié)構(gòu)區(qū)域,在線服務(wù)器主要使用SWISS-MODEL。檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)CPV-VP2的蛋白質(zhì)3 級(jí)結(jié)構(gòu)有折疊區(qū)域和螺旋區(qū)域,其顯著的特點(diǎn)為不規(guī)則。此外,還發(fā)現(xiàn)在VP2 的氨基酸位點(diǎn)上存在的殘基諾發(fā)生突變能形成不同的菌株,如CPV-2a 和CPV-2b,并且還可以影響CPV 的抗原特征。
通過(guò)NetPhos 2.0 ( http://www.cbs.dtu.dk/services/Net.Phos)預(yù)測(cè)分析CPV-VP2蛋白磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn),該蛋白存在8 個(gè)絲氨酸 (Ser)位點(diǎn),分別為27、110、156、221、226、344、519、542;酪氨酸的位點(diǎn)個(gè)數(shù)為7 個(gè),分別為79、305、338、343、378、400、561;蘇氨酸(Thr)的位點(diǎn)個(gè)數(shù)為9 個(gè),分別為31、155、187、221、242、271、388、389、455。經(jīng)典N(xiāo)etNGlyc1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGbc)預(yù)測(cè)分析CPV-VP2蛋白一共含有7 個(gè)糖基化位點(diǎn),分別為25-NGSG、47-NQTE、64-NSSR、180-NNTM、443-NYTN、505-NLTN、S17-NMSR。
通過(guò)Bcepred 在線平臺(tái)分析發(fā)現(xiàn),CPV-VP2蛋白存在6 個(gè)B 細(xì)胞抗原表位區(qū)域,見(jiàn)附表,其中22 和23 位點(diǎn)的抗原性指數(shù)最高。
通過(guò)對(duì)市區(qū)寵物醫(yī)院進(jìn)行臨床調(diào)查,共統(tǒng)計(jì)了61 例犬細(xì)小病毒病臨床病例,調(diào)查顯示,該病的治愈率為50.8% (31/61),死亡率為14.8% (9/61),遺棄或不明確的預(yù)后為34.4%(21/61)。入院時(shí)72.1% (44/61)病犬體溫超過(guò)39℃,8.2% (5/61)患者出現(xiàn)嘔吐,63.9% (39/61)病犬出現(xiàn)嚴(yán)重嘔吐和腹瀉。在所有受影響的狗中,70.5% (43/61)未接種疫苗。腸炎型細(xì)小病毒病主要發(fā)生在3 個(gè)月左右的幼犬中,潛伏期為7~14d,腹瀉后1~3d 為死亡高峰期。心肌炎在4~6 周齡的幼犬中更常見(jiàn)。該研究發(fā)現(xiàn),該病的死亡率很高,應(yīng)優(yōu)先考慮預(yù)防。目前,疫苗接種是預(yù)防控制CPV 最具有療效的辦法。臨床上,選擇弱毒病毒疫苗進(jìn)行免疫接種,過(guò)程中嚴(yán)格按照相關(guān)程序進(jìn)行,以確保免疫接種準(zhǔn)確,不會(huì)跳過(guò)分裂[2]。Lu 等研究發(fā)現(xiàn),在病毒衣殼蛋白的相關(guān)表位區(qū)域,氨基酸的非同義取代不但將抗原構(gòu)象發(fā)生一定的改變,還可以使CPV 發(fā)生進(jìn)化現(xiàn)象[3]。
目前,關(guān)于細(xì)小病毒CPV-VP2蛋白功能的研究主要集中在MVMO,VP2蛋白分子量為83ku,細(xì)胞核中出現(xiàn)磷酸化蛋白,CPV-VP2蛋白可以與DNA 序列特異性結(jié)合,具有多種蛋白酶活性,參與病毒DNA 的復(fù)制,病毒基因表達(dá)調(diào)控及多種生理過(guò)程。在病毒DNA 復(fù)制中,細(xì)小病毒以類(lèi)似于原核生物的發(fā)夾模式復(fù)制[4]。CPV-VP2蛋白特異性結(jié)合病毒復(fù)制(ACCA)2~3 序列的起始點(diǎn),并在A 單鏈DNA 識(shí)別位點(diǎn)鄰近序列CTW-WTCA (W 代表A 或T)切入切口,產(chǎn)生3'-OH 作為A引物,在細(xì)胞聚合酶作用下進(jìn)行病毒DNA 復(fù)制,然后通過(guò)CPV-VP2蛋白酪氨酸磷酸鍵共價(jià)鍵在切口的5'末端,穩(wěn)定病毒DNA 鏈[5]。就細(xì)胞毒性而言,CPV-VP2蛋白主要影響幾種轉(zhuǎn)錄因子的生理活性,從而干擾這些細(xì)胞蛋白的功能并破壞細(xì)胞周期。在病毒感染A9 成纖維細(xì)胞以產(chǎn)生子代病毒過(guò)程中,VP2 在A9 細(xì)胞中引起的形態(tài)變化,導(dǎo)致細(xì)胞破裂和子代病毒釋放。發(fā)生這種變化是因?yàn)锳9 成纖維細(xì)胞的VP2 感染選擇性地改變細(xì)胞骨架細(xì)絲和中間纖維,導(dǎo)致f-肌動(dòng)蛋白和網(wǎng)格蛋白地顯著結(jié)構(gòu)重排和降解。
附表 CPV-VP2蛋白B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)
氨基酸疏水性可用作指示物,以確定蛋白質(zhì)是否是跨膜蛋白質(zhì)。如果發(fā)現(xiàn)多個(gè)親水/疏水區(qū)域在蛋白鏈中被分離,可以用作跨膜蛋白的標(biāo)記。在該研究中預(yù)測(cè)VP2蛋白的疏水性,親水性和跨膜結(jié)構(gòu)域表明,該蛋白質(zhì)沒(méi)有顯著的跨膜區(qū)。因此,CPV-VP2蛋白可能不是膜蛋白。CPV-2a 和CPV-2b 之間的差異是氨基酸376,氨基酸376 是VP2 的主要抗原位點(diǎn)(表位A),CPV-2a 的氨基酸376 是天冬氨酸(D)和CPV 的氨基酸376。VP2-2c 是谷氨酸(E)。1990 年以后測(cè)序顯示,CPV-2a的第555 個(gè)氨基酸大多數(shù)為纈氨酸[6]。李世靜等研究發(fā)現(xiàn),在試驗(yàn)中克隆的CPV-vp2 的380 處氨基酸是天冬氨酸,418 處氨基酸是丙氨酸(A),屬于新的“CPV-2a”型[7]。早在20 世紀(jì)80 年代,由表位組成的多膚疫苗被認(rèn)為是未來(lái)的終極疫苗。由于CPV 易于進(jìn)化突變,使用天然抗原的免疫效果不是很理想,也可能引起免疫耐受。在人類(lèi)醫(yī)學(xué)中,天然抗原已被修飾以產(chǎn)生更多免疫原性抗原。但CPV-VP2 在天然抗原修飾方面的研究較少,深度研究分析CPV-VP2 的基因表位及抗原修飾的意義重大,以提高該病的預(yù)防與治愈效果。