Apelin receptor(APJ)拮抗劑F13A對小鼠抑郁樣行為的影響及起效時間*

于旭東, 劉君宇, 肖志勇, 田紹文 △

(1. 邵陽學(xué)院生理學(xué)教研室, 湖南 邵陽 422000; 2. 南華大學(xué)生理學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001； 3. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 湖南 衡陽 421001)

抑郁癥是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致殘疾的主要原因之一，給患者及其家屬帶來重大的精神和經(jīng)濟負擔[1,2]。以選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)為代表的一線抗抑郁藥物常需要3～6周的治療才見效，并且對大約三分之一的抑郁癥患者沒有作用。最近，發(fā)現(xiàn)氯胺酮(一種非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)拮抗劑)單次給藥能快速緩解抑郁癥狀并且其作用可持續(xù)數(shù)天[3]。但氯胺酮存在藥物成癮、損害認知等副作用，因此尋找新型、低毒、快速起效的抗抑郁藥物及藥物作用靶點一直是一個巨大的挑戰(zhàn)。

Apelin及其受體(apelin receptor，APJ)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是海馬和下丘腦。提示其在學(xué)習(xí)記憶，應(yīng)激調(diào)節(jié)以及抑郁癥中具有重要作用[4]。外源性給予APJ受體激動劑apelin-13可損害被動回避任務(wù)、場景恐懼和新穎物體識別任務(wù)中嚙齒類學(xué)習(xí)記憶。然而，APJ受體激動劑可改善急性應(yīng)激、慢性應(yīng)激、以及脂多糖注射引起的記憶損害。此外，apelin-13可在強迫游泳測試、習(xí)得性無助測試、重復(fù)束縛浸水應(yīng)激抑郁模型、慢性社會挫敗抑郁模型中發(fā)揮抗抑郁樣作用[5, 6]，而抑制APJ受體對抑郁樣行為的影響并不可知。

APJ受體拮抗劑F13A是由13個氨基酸組成的多肽，與apelin-13相比僅有最后一個氨基酸不同，其可與apelin競爭性結(jié)合APJ受體，但無生物學(xué)活性。強迫游泳測試是一種普遍接受用于預(yù)測藥物抗抑郁作用的行為學(xué)范式，在實驗一開始嚙齒類努力攀爬、游泳試圖逃離水桶。然而多次失敗后，嚙齒類就會出現(xiàn)四肢靜止不動，漂浮于水面之上的 “絕望”行為。本文基于強迫游泳范式擬探索APJ受體拮抗劑F13A對小鼠抑郁樣行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性昆明小鼠(35～40 g)購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，小鼠單籠飼養(yǎng)，自由攝水攝食，放置于恒溫25℃、恒定的12 h光照/黑暗循環(huán)(光照時間07:00—19:00)的鼠房中。行為學(xué)前連續(xù)5 d撫摸小鼠每天3 min，以適應(yīng)環(huán)境和實驗操作者。所有實驗程序均經(jīng)南華大學(xué)實驗動物使用委員會批準，并完全按照美國國家衛(wèi)生研究院關(guān)于和使用實驗室動物的指南進行。

1.2 實驗設(shè)計

實驗分三批小鼠進行，第一批小鼠隨機分成對照組(Control)，F(xiàn)13A組(F13A)和氯胺酮組(ketamine)，每組9只，其中對照組小鼠腹腔注射生理鹽水(10 ml/kg，ip)+側(cè)腦室注射生理鹽水(1μl，i.c.v)，F(xiàn)13A組小鼠腹腔注射生理鹽水(10 ml/kg，ip)+側(cè)腦室注射F13A(1μl，i.c.v)，氯胺酮組小鼠腹腔注射氯胺酮(10 ml/kg，ip)+側(cè)腦室注射生理鹽水(1μl/只，i.c.v)，30 min后進行第一次強迫游泳測試(forced swimming test 1，F(xiàn)ST1)，F(xiàn)ST1后24 h進行第二次強迫游泳測試(forced swimming test 2，F(xiàn)ST2)。為排除活動度對實驗結(jié)果的影響，第二批小鼠隨機分為對照組，F(xiàn)13A組和氯胺酮組，每組9只，藥物注射和第一批小鼠相同，注射后30 min進行第一次自發(fā)活動測試(locomotor activity test 1，LMT1)，LMT1前24 h進行自發(fā)活動習(xí)慣化，LMT1后24 h進行第二次自發(fā)活動測試(locomotor activity test 2，LMT2)。第三批小鼠隨機分為對照組，F(xiàn)13A組和氯胺酮組，每組9只，藥物注射和第一批小鼠相同，注射后30 min進行FST1，F(xiàn)ST1前24 h進行強迫游泳應(yīng)激(forced swimming stress，F(xiàn)SS)FST1后24 h進行第二次強迫游泳測試FST2(圖1)。

Fig.1Schematic of the experimental design

FSS: Forced swimming stress pretreatment; FST1: Forced swimming test 1; FST2: Forced swimming test 2

1.3 強迫游泳程序

強迫游泳程序分為應(yīng)激預(yù)處理(第一日)和強迫游泳測試(第二日、第三日)兩個階段，在應(yīng)激預(yù)處理(FSS)階段，小鼠放入裝有15 cm水(23±1)℃的透明有機玻璃圓筒(高30 cm，直徑20 cm)中進行15 min游泳，有機玻璃圓桶放入隔音箱(800 Lux)。在強迫游泳測試(forced swimming test，F(xiàn)ST)階段，小鼠再次放入條件相同有機玻璃桶內(nèi)，連續(xù)2 d，每天6 min。隔音箱內(nèi)數(shù)碼攝像機記錄小鼠各階段行為。由受過訓(xùn)練的觀察者雙盲統(tǒng)計小鼠在6 min測試中最后4 min的不動行為，并用秒表記錄小鼠不動行為持續(xù)的時間。動物除了保持頭部高于水面所需的運動外無額外運動即為不動。

1.4 自發(fā)活動測試

自發(fā)活動測試在自發(fā)活動測試箱(45 cm×45 cm×60 cm)中進行，自發(fā)活動測試箱內(nèi)光照強度200 Lux，噪聲65 dB，箱頂一攝像頭記錄小鼠行為，箱底平均分割成36個正方形方格(7.5 cm×7.5 cm)。自發(fā)活動測試包括習(xí)慣化和測試兩個階段，在第一日進行習(xí)慣化階段，小鼠放入測試箱中，自由活動15 min后將小鼠放回鼠籠，清除測試箱內(nèi)糞便并用75%酒精擦拭清除遺留氣味以免干擾下一只小鼠的行為。第二日和第三日進行測試階段(LMT1和LMT2)，在這兩天分別將小鼠放入測試箱中自由活動6 min。攝像頭記錄測試階段小鼠的行為，熟練者雙盲統(tǒng)計小鼠穿越的格子數(shù)以此判斷小鼠的活動度，小鼠穿過的網(wǎng)格越多小鼠的活動度越強。

1.5 側(cè)腦室置管及微量給藥

小鼠腹腔注射水合氯醛(5%，0.1 ml/10 g)，待麻醉后，固定于腦立體定位儀上。用酒精棉球擦拭小鼠頭部，剪去頭部毛發(fā)與皮膚，暴露其顱骨，采用40%過氧化氫溶液刮凈顱骨表面組織并止血，暴露顱骨前囟點。每只小鼠右側(cè)側(cè)腦室植入無菌導(dǎo)管(62003型，瑞沃德生命科學(xué)有限公司，中國深圳)，小鼠側(cè)腦室微注射坐標以前囟為原點，向后0.3 mm，右旁開1.0 mm進行顱骨水平面定位，并用鉆頭鉆孔。埋植導(dǎo)管以前囟點為原點向下2.5 mm，套管用三顆不銹鋼螺釘和牙科水泥固定在顱骨上，術(shù)后小鼠單籠飼養(yǎng)恢復(fù)5～7 d。側(cè)腦室微量注射在動物清醒狀態(tài)(用毛巾輕微束縛)下進行，用微量注射泵通過引導(dǎo)管向側(cè)腦室注射F13A(每只6 μg/μl)或生理鹽水(每只1μl)，注射速度為1 μl/2 min. 實驗完成后，通過組織學(xué)檢查套管的位置，并剔除導(dǎo)管錯位動物的數(shù)據(jù)。

1.6 藥物

F13A (Glu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Ala)購自吉爾生化有限公司(上海)，F(xiàn)13A溶于生理鹽水后 -80℃保存，注射時置于冰中，側(cè)腦室注射劑量為每只6 μg[5]。鹽酸氯胺酮注射液由福建古田藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，劑量基于之前的研究[7]，用生理鹽水稀釋,最終濃度為2 mg/ml，腹腔注射體積為10 ml/kg。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)都以均值±標準誤(mean±SEM)表示，使用Sigma Stat 3.5 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA) 和非配對的t檢驗，事后分析使用Tukey HSD。

2 結(jié)果

2.1 在無FSS預(yù)處理時，F(xiàn)13A實施30 min對小鼠FST1及24 h后FST2的影響。

在FST1階段(圖2A)，one-way ANOVA表明，各組小鼠不動時間存在顯著性差異(P<0.05)。post-hoc分析表明，氯胺酮組小鼠不動時間顯著性低于對照組(P<0.01)；而F13A組小鼠不動時間與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

在LMT1階段(圖2B)，one-way ANOVA表明，各組小鼠穿越的格子數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，表明F13A不影響小鼠活動水平。

這些結(jié)果表明氯胺酮而非F13A在FST1中發(fā)揮快速起效的抗抑郁樣作用。

**P<0.01vscontrol group

在FST2階段(圖3A)，one-way ANOVA表明，各組小鼠不動時間存在顯著性差異(P<0.01)。post-hoc分析表明， F13A組小鼠不動時間顯著性低于對照組(P<0.01 )；氯胺酮組小鼠顯示出降低的趨勢但沒有顯著性。

在LMT2階段(圖3B)，one-way ANOVA表明，各組小鼠穿越的格子數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，表明F13A不影響小鼠活動水平。

這些結(jié)果表明F13A而非氯胺酮在FST2中發(fā)揮抗抑郁樣作用。

**P<0.01vscontrol group

2.2 在FSS預(yù)處理后，F(xiàn)13A實施30 min對小鼠FST1及24 h后FST2的影響。

造成F13A在FST1無抗抑郁樣作用而在FST2發(fā)揮抗抑郁樣作用的原因可能是(1)F13A抗抑郁作用在應(yīng)激后起效；(2)F13A發(fā)揮抗抑郁樣作用是慢性起效(24 h)而非急性起效(30 min)。為明確F13A在FST1中無抗抑郁樣作用而在FST2中發(fā)揮抗抑郁樣作用的原因，本文在FSS預(yù)處理后，探索F13A實施30 min對小鼠FST1及24 h后FST2的影響。

在FST1階段(圖4A)，one-way ANOVA表明，各組小鼠不動時間存在顯著性差異(P=0.01)。post-hoc分析表明，氯胺酮、F13A組小鼠不動時間顯著性低于對照組(P<0.01 或P<0.05 )；此外，如圖2B所示，各組小鼠穿越的格子數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。這些結(jié)果表明F13A、氯胺酮在FST1中發(fā)揮抗抑郁樣作用。

在FST2階段(圖4B)，one-way ANOVA表明，各組小鼠不動時間存在顯著性差異(P<0.05)。post-hoc分析表明， F13A組小鼠不動時間顯著性低于對照組(P<0.05)；氯胺酮組小鼠顯示出降低的趨勢但沒有顯著性差異。此外，如圖3B所示，各組小鼠穿越的格子數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。這些結(jié)果表明F13A而非氯胺酮在FST2發(fā)揮抗抑郁樣作用。

以上結(jié)果表明F13A發(fā)揮快速的抗抑郁樣作用，并且這種作用依賴于應(yīng)激預(yù)處理。

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3 討論

當前研究表明，在無強迫游泳應(yīng)激預(yù)處理的情況下，在FST1中氯胺酮而非F13A具有快速起效的抗抑郁樣作用；在經(jīng)歷過FST1后， F13A而非氯胺酮顯示出抗抑郁樣作用。在強迫游泳預(yù)處理后，F(xiàn)13A同氯胺酮一樣在FST1中呈現(xiàn)抗抑郁樣作用并且其作用可持續(xù)24 h后的FST2。

APJ受體是孤兒G蛋白偶聯(lián)受體，Apelin與Apelin受體(APJ)結(jié)合，發(fā)揮其生理功能。Apelin和APJ廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括參與下丘腦和海馬等應(yīng)激反應(yīng)的邊緣結(jié)構(gòu)。最近的研究表明，外周的Apelin系統(tǒng)在心血管疾病、急性肺損傷、胃功能和脂肪代謝中起著重要的作用[8, 9]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，側(cè)腦室注射Apelin調(diào)節(jié)血壓，疼痛，攝食行為和垂體激素釋放[10, 11]。 大量體外和體內(nèi)研究也顯示中樞apelin發(fā)揮神經(jīng)保護作用，如中樞Apelin實施在嚙齒動物中發(fā)揮抗焦慮、治療腦缺血和抑制神經(jīng)炎癥的作用[12-14]。當前研究表明，側(cè)腦室注射APJ受體拮抗劑F13A在強迫游泳測試中發(fā)揮抗抑郁樣作用。然而，之前研究表明側(cè)腦室注射APJ受體激動劑Apelin在強迫游泳測試中發(fā)揮抗抑郁樣作用[6]，這與當前研究并不矛盾，強迫游泳后可上調(diào)海馬內(nèi)Apelin、APJ信號以及下調(diào)下丘腦內(nèi)Apelin、APJ信號。海馬而非下丘腦注射Apelin，可產(chǎn)生抗抑郁樣作用[15]，提示應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬內(nèi)Apelin，APJ的上調(diào)及下丘腦內(nèi)Apelin、APJ的下調(diào)是機體的適應(yīng)性反應(yīng)，并且側(cè)腦室注射Apelin產(chǎn)生的抗抑郁樣作用是通過海馬而非下丘腦起作用的。除此之外，海馬內(nèi)注射F13A對強迫游泳測試中抑郁樣行為沒有影響[15]。因此側(cè)腦室注射F13A可能促進下丘腦Apelin、APJ信號這一適應(yīng)反應(yīng)從而發(fā)揮抗抑郁樣作用。這種腦區(qū)的特異性在其他信號分子中也存在，例如，上調(diào)BDNF發(fā)揮抗抑郁樣，而BDNF受體(TrkB)拮抗劑ANA-12也發(fā)揮抗抑郁樣作用[16]。除此之外，皮質(zhì)酮增加可誘導(dǎo)嚙齒類抑郁樣行為，Apelin，APJ信號參與機體皮質(zhì)酮的調(diào)節(jié)，側(cè)腦室apelin注射可誘導(dǎo)皮質(zhì)酮升高[17]，APJ受體敲除可抑制小鼠強迫游泳應(yīng)激中皮質(zhì)酮反應(yīng)[18]。推測F13A發(fā)揮抗抑郁樣作用可能與降低應(yīng)激誘導(dǎo)的皮質(zhì)酮升高有關(guān)。

許多信號的抑制劑發(fā)揮抗抑郁作用依賴于應(yīng)激狀態(tài)，而對正常的個體沒有影響。APJ受體激動劑發(fā)揮抗抑郁作用依賴于應(yīng)激，且在無應(yīng)激條件下Apelin可導(dǎo)致焦慮樣行為以及皮質(zhì)酮的升高。當前研究表明，在無應(yīng)激條件下，F(xiàn)13A在FST1中無抗抑郁樣作用，而經(jīng)歷FST1后，F(xiàn)13A在FST2中顯示出抗抑郁樣作用。這可能是F13A抗抑郁作用在應(yīng)激后起效；而在 FSS預(yù)處理后進行FST1，結(jié)果顯示F13A 在FST1中發(fā)揮抗抑郁樣作用，進一步說明F13A發(fā)揮抗抑郁作用依賴于應(yīng)激。在無應(yīng)激時，Apelin、APJ信號保持穩(wěn)定，而在應(yīng)激條件下，Apelin、APJ信號發(fā)生迅速變化，其中束縛應(yīng)激2 h可使胃內(nèi)Apelin迅速上升[19]，慢性束縛浸水應(yīng)激誘導(dǎo)海馬Apelin、APJ信號升高[20]。應(yīng)激預(yù)處理導(dǎo)致Apelin、APJ信號的紊亂，其中海馬內(nèi)Apelin，APJ的上調(diào)及下丘腦內(nèi)Apelin、APJ下調(diào)。推測F13A抗抑郁作用可能是通過調(diào)節(jié)應(yīng)激中Apelin、APJ信號的變化發(fā)揮作用的。

目前現(xiàn)行抗抑郁藥物起效緩慢，急需快速持久抗抑郁癥藥物。關(guān)于快速起效和持久起效的抗抑郁作用雖然沒有明確的時間界定,但有不少研究對藥物的快速抗抑郁作用進行了描述。如氯胺酮注射后30 min發(fā)揮抗抑郁樣作用，越鞠醇提物灌胃后2 h發(fā)揮抗抑郁樣作用[21]；也有研究描述了持久起效的抗抑郁樣作用。如氯胺酮注射后其抗抑郁作用可持續(xù)到24 h后。本研究選用30 min作為快速抗抑郁的時間點，24 h作為持久抗抑郁的時間點，氯胺酮作為陽性對照。研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)激條件下，F(xiàn)13A在FST1前30 min注射發(fā)揮抗抑郁作用，并且其抗抑郁作用持續(xù)到24 h后的FST2。然而氯胺酮在FST2中抗抑郁作用消失，這似乎與之前氯胺酮持久的抗抑郁作用矛盾。在之前的研究中氯胺酮注射后24 h直接進行行為學(xué)測試，在此之間沒有應(yīng)激的干擾[7, 22]。而在當前的研究中氯胺酮注射后30 min后先進行一次FST1測試， 24 h后再進行一次FST2測試。強迫游泳又作為一種強應(yīng)激，可能是這種應(yīng)激抵消了氯胺酮在FST2中的作用。抑郁癥病人對壓力敏感、抗應(yīng)激能力差，這也是抑郁癥容易反復(fù)的原因。F13A抗抑郁可同時拮抗給藥后的強應(yīng)激干擾，與氯胺酮相比具有更大的優(yōu)勢。

強迫游泳測試可用于預(yù)測藥物的抗抑郁作用，然而在本研究中評價F13A抗抑郁作用的行為學(xué)太過單一，且缺乏相應(yīng)的生化指標。在將來的研究中還需應(yīng)用慢性不可預(yù)測應(yīng)激、慢性社會挫敗等更接近抑郁癥病人的動物模型進行評價F13A的抗抑郁樣作用以及檢測相關(guān)蛋白的表達。