綿白糖中還原糖分含量測定方法的對比研究

趙亞紅，楊 麗，劉東旭，劉 琳，遲雅麗，王 健,2，陳花山*，趙抒娜

(1中糧糖業(yè)遼寧有限公司，遼寧營口115212；2中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京昌平102209；3中糧屯河糖業(yè)股份有限公司，農(nóng)業(yè)部糖料與番茄質(zhì)量安全控制重點實驗室，新疆昌吉831100)

0 前言

綿白糖簡稱綿糖，是人們喜愛的調(diào)味增味甜味劑，其晶粒細小、細膩、質(zhì)地綿軟，適合直接食用，同時也可以為食品上色，在做面制品時也更易溶于面團中[1-2]。由于綿白糖在生產(chǎn)過程中噴入了 2.5%左右的轉(zhuǎn)化糖漿，所以其還原糖分高于普通白砂糖的還原糖分。對于綿白糖中的還原糖分，如果含量過高會導(dǎo)致綿白糖吸潮滋生微生物，不利于綿白糖的保存，而含量過低則會影響綿白糖的風味，因此還原糖分被列為綿白糖質(zhì)量控制國家標準規(guī)定的必檢指標。GB/T 1445-2018《綿白糖》[3]規(guī)定綿白糖中還原糖分標準在1.5%～2.5%之間，在檢測方法上，大部分企業(yè)都是依據(jù)QB/T 5012-2016《綿白糖試驗方法》[4]中的蘭-艾農(nóng)恒容法檢測綿白糖還原糖分。該方法用樣液滴定一定量的斐林氏試劑，滴定前加入預(yù)測的水分以保持最終容量恒定，根據(jù)耗用樣液的量，查表得校正系數(shù)，計算還原糖分的含量。該方法操作復(fù)雜，計算較繁瑣，嚴重限制其在綿白糖生產(chǎn)企業(yè)對多個批次產(chǎn)品檢測時的應(yīng)用，所以需要開發(fā)出一種操作簡便、節(jié)省時間、準確度高、重復(fù)性好的檢測方法來檢測綿白糖中的還原糖分。

目前，國內(nèi)外學(xué)者圍繞食品中還原糖分檢測開發(fā)了一系列的方法。張弛等[5]綜述比較了食品中還原糖測定方法，分析比較了各種方法檢驗的優(yōu)缺點。張學(xué)英等[6]通過斐林試劑滴定法和 3,5-二硝基水楊酸比色法測定菊芋中還原糖分含量，對于較高濃度樣品的檢測，平行樣檢測 RSD分別為 2.00%和1.68%；但對于濃度較低(比色液糖含量低于1500 μg以下)樣品，滴定法檢測樣品平行性較差，精密度一般在 8%～13%，而比色法精密度一般在 2.0%～4.5%。田翔等[7]建立了 3,5-二硝基水楊酸比色法，通過與GB/T 5513-2008《糧油檢驗 糧食中還原糖和非還原糖測定》[8]中鐵氰化鉀法比較分析，3,5-二硝基水楊酸比色法可代替國標方法測定糜子還原糖。馬蓉等[9]和袁夢等[10]采用高效液相色譜(HPLC)-示差折光測定蜂蜜中還原糖的含量；梁智安等[11]利用HPLC-示差折光測定酒中的總糖和還原糖。HPLC-示差折光法對樣品沒有特殊要求，按一定濃度配制溶液即可測定，可以快速檢測樣品中的糖類物質(zhì)，具有不破壞樣品、重現(xiàn)性好、分辨率高等優(yōu)點[12]，在測定糖類物質(zhì)方面具有獨特優(yōu)勢，操作簡單，結(jié)果準確可靠[13-15]。

目前，測定綿白糖還原糖的方法只有國家標準要求的斐林試劑滴定法，研究HPLC-示差折光法測定綿白糖還原糖分鮮有報道。由于綿白糖與蜂蜜、酒的體系存在較大差異，需針對綿白糖特定體系開發(fā)還原糖分含量的檢測方法。本文的目的在于以斐林試劑滴定法檢測的數(shù)據(jù)為理論值，采用HPLC-示差折光法測定綿白糖還原糖分，通過分析2種方法的相關(guān)性，并提供可靠的數(shù)據(jù)來支撐HPLC-示差折光法的準確性論證，推動HPLC-示差折光法在快速檢測綿白糖還原糖分的應(yīng)用。

1 試劑與儀器

1.1 主要試劑

綿白糖，中糧糖業(yè)遼寧有限公司；乙腈(色譜純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；磷酸氫二鈉(分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；磷酸二氫鈉(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；葡萄糖(標準品)，中國食品藥品檢定研究院；果糖(標準品)，中國食品藥品檢定研究院。

1.2 主要儀器

液相色譜儀、示差折光檢測器，大連依利特分析儀器有限公司；超純水器，Master系列；0.45 μm水相濾膜，天津津騰實驗設(shè)備有限公司；真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 干燥失重含量的測定

依據(jù)QB/T 5012-2016《綿白糖試驗方法》[4]進行檢測，將樣品在一定溫度及真空度的條件下進行干燥后稱量，根據(jù)干燥前后樣品失去的質(zhì)量計算出樣品的干燥失重，每個樣品重復(fù)測定3次。

2.2 標準溶液的配制

果糖標準溶液配制：準確稱取果糖標準品0.0500 g，精確至0.0001 g，用超純水溶解并定容至5 mL，搖勻，即得濃度為10 g/L的果糖標準溶液。

葡萄糖標準溶液配制：準確稱取葡萄糖標準品0.0500 g，精確至0.0001 g，用超純水溶解并定容至5 mL，搖勻，即得濃度為10 g/L的葡萄糖標準溶液。

2.3 標準曲線的制備

分別稱取果糖和葡萄糖標準品0.500 g，溶解并定容至50 mL，配制成含量為10 g/L的混合標準貯備溶液。分別吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL上述混合標準品貯備液于10 mL的容量瓶中，用超純水定容，制備分別相當于0.5、1、2、3、4 g/L的標準品溶液，溶液過 0.45 μm水相濾膜備用。分別以 2種糖的濃度為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，進行線性回歸分析?；貧w方程見表1，2種糖線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.998。

色譜條件：依利特Hypersil-NH2-S色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈+磷酸鹽緩沖液=73%+27%(V︰V)，pH=5；流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃；進樣體積：20 μL；依利特RID檢測器，檢測池溫度：40℃。

表1 果糖和葡萄糖的標準曲線方程

2.4 綿白糖測定

稱取綿白糖樣品20.00 g，精確至0.01 g，用超純水溶解，并定容至400 mL，搖勻。稀釋3倍后，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾后，根據(jù)以上設(shè)定的色譜條件進行上機測定，每個樣品重復(fù)測定3次。

2.5 斐林試劑法

根據(jù)QB/T 5012-2016《綿白糖試驗方法》[4]的方法配制溶液，采用斐林試劑法滴定還原糖，每個樣品平行測定3次。

2.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，所得數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件進行多個樣本均數(shù)之間兩兩比較的成對樣本t檢驗，配對樣本相關(guān)性P＜0.05時具有樣本相關(guān)性顯著。

3 結(jié)果與討論

3.1 譜圖分析

流動相：乙腈+磷酸鹽緩沖液=73%+27%(V︰V)，pH=5；流速：1.0 mL/min，分別將綿白糖樣品、葡萄糖標準溶液和果糖標準溶液進樣，其峰型分別如圖1、圖2、圖3所示，出峰時間見表2。

圖1 綿白糖樣品(濃度為13.33 g/L)

圖2 果糖標準品

圖3 葡萄糖標準品

由圖1和表2可知，綿白糖樣品共有3個峰，將樣品中的第1個峰和第2個峰的出峰時間與圖2和圖3的果糖和葡萄糖標準品進行對照，可以發(fā)現(xiàn)果糖、葡萄糖出峰時間相近，表明圖1第1個峰為果糖峰，第2個峰為葡萄糖峰，則第3個峰為蔗糖峰。由圖1可知綿白糖組成成分較單一，由果糖、葡萄糖和蔗糖組成，一般蔗糖分不具有還原性，還原糖分的含量實則為果糖和葡萄糖含量的總和。在計算還原糖分含量時，蔗糖分含量也可以一同計算。此外，按照流動相條件：乙腈+磷酸鹽緩沖液=73%+27%(V︰V)，pH=5；流速：1.0 mL/min，可使檢測時成分出峰時間較短，并具有較高分離度，能夠滿足化驗室快速檢測的要求。

3.2 檢測結(jié)果

表2 樣品與標準品的出峰時間

選取還原糖分含量不同的綿白糖樣品，按照QB/T 5012-2016《綿白糖試驗方法》檢測干燥失重含量，同時采用HPLC-示差折光法和斐林試劑滴定法2種方法檢測還原糖分含量，結(jié)果如表3所示。由于綿白糖的電導(dǎo)灰分遠低于蔗糖、還原糖分和水分，在計算總糖分時忽略電導(dǎo)灰分的影響，而蔗糖分和還原糖分的含量則根據(jù)標準曲線計算所得的質(zhì)量濃度進行計算，計算公式如下所示：

總糖分(%)=100-水分含量·······················(1)

式中：C果糖為綿白糖樣品根據(jù)果糖的標準曲線計算得到的濃度(g/L)；C葡萄糖為綿白糖樣品根據(jù)葡萄糖的標準曲線計算得到的濃度(g/L)；C樣品為綿白糖樣品進樣分析的濃度(g/L)。

3.3 方法對比分析

表3 還原糖分檢測結(jié)果對比

通過圖1的譜圖分析可以看出綿白糖由3種糖組成，分別為果糖、葡萄糖和蔗糖，經(jīng)過計算分析可知，果糖、葡萄糖含量之和與斐林試劑法檢測的還原糖分含量接近，通過SPSS軟件來研究HPLC-示差折光法與斐林試劑法的相關(guān)性。根據(jù)SPSS 25.0軟件分析的結(jié)果可知：2種檢測方法下的平均值分別為2.0138 g/100g和2.0577 g/100g，標準差分別為0.32351和0.34245，說明HPLC-示差折光法的均值較低，標準差較小。經(jīng)計算2種檢測方法相關(guān)系數(shù)為0.983(P＜0.05)，由此得出2種方法的檢測結(jié)果相關(guān)性顯著。由表2可知，由水分含量可計算還原糖含量，HPLC-示差折光法RSD值為0.06%～0.9%，斐林試劑滴定法RSD值為0.11%～3.1%，由此得出HPLC-示差折光法要明顯低于斐林試劑法的實驗相對標準偏差，表明數(shù)據(jù)的精密度較好。

斐林試劑滴定法用樣液滴定一定量的斐林氏試劑，滴定前加入預(yù)測的水分以保持最終容量恒定，根據(jù)耗用樣液的量，查表得校正系數(shù)，計算還原糖分的含量。該方法操作復(fù)雜，計算較繁瑣，而且檢測結(jié)果易受試劑溶液顏色的影響，客觀因素對其影響因素較大，終點不易判定。示差折光檢測器是通過連續(xù)測定色譜柱流出液折光率的變化而對樣品濃度進行測定的，通過標準品對所分離的組分進行標定，就可以準確快速地得到還原糖的質(zhì)量。和斐林試劑法相比，所得結(jié)果偏差值較小，且操作簡單、快速，客觀因素對其影響較小。

4 結(jié)論

本文采用HPLC-示差折光檢測法和斐林試劑滴定法檢測綿白糖中還原糖分的含量，旨在對比采用HPLC-示差折光法與斐林試劑法對綿白糖還原糖分含量進行檢測的方法差異，初步探討研究了采用HPLC-示差折光法檢測綿白糖還原糖分含量的可行性。與斐林試劑滴定法相比，利用HPLC-示差折光法測定綿白糖中的還原糖，方法簡單，操作快捷方便，能有效地測定出其還原糖含量，測定其結(jié)果準確可靠。本研究為HPLC-示差折光法的準確性提供可靠的數(shù)據(jù)支撐，有助于推動HPLC-示差折光法在快速檢測綿白糖還原糖分的應(yīng)用，提高制糖企業(yè)日常檢驗分析的效率。