酮康唑致人L02肝細胞毒性差異蛋白鑒定

苗玉發(fā) 康慧君 王曉姝 李路路 張河戰(zhàn)

酮康唑是一種吡咯類抗真菌藥，文獻報道可以通過干擾細胞色素P-450的活性，抑制真菌細胞膜主要固醇類物質(zhì)的生物合成，損傷真菌細胞膜并改變其通透性，導(dǎo)致重要的細胞內(nèi)物質(zhì)外漏，從而達到殺菌抑菌作用。KTZ還可以抑制真菌的三酰甘油和磷脂的生物合成，抑制氧化酶和過氧化酶的活性，引起細胞內(nèi)過氧化氫積聚導(dǎo)致細胞亞微結(jié)構(gòu)變性和細胞壞死[1]。2011年8月31日，國家食品藥品監(jiān)督管理局在第40期《藥品不良反應(yīng)信息通報》中提醒警惕KTZ 200mg口服片劑的嚴重肝毒性，但是，KTZ致人肝損傷的毒性機制仍不完全清楚 。

本研究將KTZ和人L02肝細胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)體外肝細胞毒性，通過雙向電泳法篩選差異蛋白，并通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)種類，探討KTZ對人肝細胞的毒性機制。

材料與方法

1.主要試劑：KTZ(美國Sigma公司)；L02人肝細胞株(中科院上海細胞生物學(xué)研究所)；RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMSO(美國Sigma公司)；考馬斯亮藍(美國Promega公司)；0.25%胰酶(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；重泡漲液(美國Biorad公司)；蛋白Marker(中科院上海生物化學(xué)研究所)；CCK-8檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；活性氧檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；全細胞蛋白提取試劑盒(美國Epigentek公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.主要儀器：5810R型臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)；全自動酶標儀(美國Thermo公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司) ；恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；電子分析天平(日本島津公司)；Ettan IPGphor等電聚焦電泳儀(瑞典Amersham公司)；Ettan DALT twelve system SDS-PAGE電泳儀(瑞典Amersham公司)；UMAX ImageScanner凝膠掃描儀(美國GE healthcare公司)；UV-2550分光光度計(日本島津公司)； ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)。

3.實驗方法：(1)藥液的配制：KTZ臨用前以培養(yǎng)液稀釋至實驗所需的終濃度。(2)細胞培養(yǎng)：復(fù)蘇凍存的細胞，離心去除凍存液，加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液(pH值7.2)，于37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)。細胞生長到80%后，加入lml 消化液(含0.02%EDTA，0.25%胰酶)消化，待細胞變圓，間隙增大時，棄消化液，加入2ml培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打制成單細胞懸液待用[2]。(3)CCK-8法檢測KTZ對人L02肝細胞增殖的影響：將單細胞懸液調(diào)至105/ml濃度，96孔板每孔100μl放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，至完全貼壁，然后加入30、50、80、100mg/L濃度的KTZ 10μl，培養(yǎng)2、4、6和8h后收集上清，加入新鮮不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基100μl，加CCK-8溶液10μl繼續(xù)培養(yǎng)2～4h，然后測定450nm處的加藥細胞的吸光度值(試驗組A值)。同時設(shè)置空白組(培養(yǎng)基和CCK-8溶液，無細胞)和對照組(不加藥的培養(yǎng)基和CCK-8溶液，有細胞)。細胞增殖抑制率(%)= (對照組A值-試驗組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%[3,4]。實驗重復(fù)3次，計算平均增殖抑制率。(4)流式細胞術(shù)檢測KTZ對細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的影響：將單細胞懸液調(diào)至105/ml濃度，96孔板每孔加100μl后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，至完全貼壁，然后加入30、50、80、100mg/L濃度的KTZ 10μl共培養(yǎng)4h和6h，棄上清，PBS洗1次，加DCFH-DA(5μmol/L) 50μl，37°C孵育30min，含3% FBS的PBS洗兩次，加50μl PBS重懸，上機檢測[5]。對照組細胞內(nèi)熒光強度設(shè)定為100，其他組熒光強度與對照組進行比較，來表示胞內(nèi)活性氧的多少。(5)蛋白樣品制備：將80mg/L KTZ培養(yǎng)6h的人肝細胞作為進一步研究對象。收集的對照組細胞和實驗組細胞分別設(shè)有3個復(fù)樣，對照組樣本編號為C1-55622、C1-55623和C1-55630，實驗組樣本編號為T1-55625、T1-55626和T1-55627。蛋白質(zhì)提取方法按照美國Epigentek公司提供的說明書進行，Brad-ford 法測定蛋白濃度，液氮保存?zhèn)溆谩?6)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)：將對照組和實驗組各1.0mg蛋白質(zhì)加入重泡漲液中，使總體積為450μl，用等電聚焦儀按如下程序自動進行： 12h重泡漲；250V，0.5h；1000V，0.5h；8000V，9h，總電壓時間約為52000Vh。結(jié)束后, 將膠條分別放入5ml平衡液Ⅰ(2% DTT)和5ml 平衡液Ⅱ(含2.5% 碘乙酰胺)中各平衡15min, 然后進行第二向垂直平板SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[6～8]。(7)圖像分析：將膠塊放入考馬斯亮藍R-250中染色，然后在脫色液中脫色至背景清晰，得到6張考染圖。然后對凝膠進行拍攝，用Imagemaster 7.0軟件對圖片進行分析，選取3倍以上的差異點作為目的蛋白進行質(zhì)譜分析。(8)差異蛋白酶解及質(zhì)譜分析： 沿染色區(qū)邊緣切下凝膠中目的蛋白質(zhì)點，放入0.5ml試管中，200μl超純水37℃浸泡30min，在100μl脫色液[ACN (乙腈)∶100mmol/L碳酸氫銨=3∶7]中震蕩脫色30min，重復(fù)2～3遍，直到膠塊和脫色液無色；將膠塊浸入100% ACN中15min，真空離心干燥5min；加入10～15μl Trypsin酶液，4℃放置45min，37℃空氣浴9～11h，吸出反應(yīng)液置EP 管中；加入33%ACN和0.1%TFA(三氟乙酸)50μl, 輕微振蕩萃取30min，瞬時離心，吸上清置EP管中。再用含66%ACN和0.1%TFA，以及含100% ACN和0.1%TFA的萃取液各萃取一次?；旌仙鲜鲆后w(反應(yīng)液和3次萃取液)冷凍真空抽干至5～6μl，4℃冰箱保存。質(zhì)譜分析時凍干樣品管中加入3μl 50% ACN/0.5% TFA 溶解，加基質(zhì)溶液3μl, 混勻后取1μl 點樣于不銹鋼板上，空氣自然干燥后在ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀上進行分析[9～11]。(9)數(shù)據(jù)庫檢索：使用Mascot檢索軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫中檢索質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)。使用國際互聯(lián)網(wǎng)UniProt提供的數(shù)據(jù)庫查詢蛋白質(zhì)功能，查詢地址：https://www.uniprot.org/。

結(jié) 果

1.KTZ對人L02肝細胞增殖的抑制作用：細胞增殖抑制率隨著KTZ劑量的增加和作用時間的延長而顯著上升。KTZ濃度為80mg/L和100mg/L時，與對照組比較，各時間點對細胞的增殖抑制比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。KTZ濃度為50mg/L時，作用4h后對細胞的增殖抑制比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。KTZ濃度為30mg/L時，作用6h后對細胞的增殖抑制比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細胞增殖抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)，濃度越高，對細胞的增殖抑制作用越強，增殖率為負數(shù)時，表示KTZ在該濃度對細胞無抑制作用，結(jié)果見圖1。

圖1 不同KTZ濃度作用人L02肝細胞不同時間后細胞增殖的抑制率

2.KTZ對人L02肝細胞ROS的影響：當KTZ濃度≥80mg/L時，與對照組比較，4h和6h兩個時間點的熒光強度均顯著升高(P<0.01)，即胞內(nèi)活性氧顯著性升高，結(jié)果見圖2。

圖2 不同KTZ濃度作用人L02肝細胞不同時間后細胞內(nèi)熒光強度比值與對照組比較，*P<0.01

3.雙向凝膠電泳結(jié)果：通過細胞增殖抑制實驗和胞內(nèi)ROS實驗發(fā)現(xiàn)，當KTZ濃度≥80mg/L時，在不同時間點，都會產(chǎn)生顯著性的細胞增殖抑制和細胞凋亡。因此，收集與80mg/L KTZ共培養(yǎng)6h的人肝細胞作為實驗組，進行蛋白提取及雙向凝膠電泳實驗。通過與對照組比較，共獲得17個蛋白差異點。與對照組比較，含量增加的點有38、149、360、427、1683、1750、1763、1765、1827和1836(圖3，以點38為代表)；與對照組比較，含量減少的點有93、375、399、423、451、1098和1992(圖4，以點399為代表)。

圖3 點38的雙向凝膠電泳圖

圖4 點399的雙向凝膠電泳圖

4.差異蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果：質(zhì)譜鑒定出有意義的蛋白，且通過UniProt數(shù)據(jù)庫查詢與細胞毒性相關(guān)的上調(diào)蛋白4個，下調(diào)蛋白 3個，結(jié)果見表1。

表1 差異蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果

討 論

真核生物60S酸性核糖體蛋白(60S acidic ribosomal protein)大亞基上有P0、P1和P2 3種核糖體蛋白，由于它們的等電點在酸性范圍內(nèi)，且通常又被一些蛋白激酶磷酸化，故稱為酸性核糖體P蛋白。這些蛋白質(zhì)在核糖體上形成由五聚體復(fù)合物(P1/P2)2-P0組成的向外凸出的莖區(qū)結(jié)構(gòu)，此莖區(qū)與核糖體上的28S rRNA的一個保守結(jié)構(gòu)域共同形成一個GTPase相關(guān)位點，并在蛋白質(zhì)翻譯延伸過程中起重要作用。研究表明酸性核糖體蛋白P參與蛋白質(zhì)的合成，維持生命穩(wěn)定性，還具有參與DNA修復(fù)，細胞發(fā)育和細胞分化等調(diào)控過程。此外，酸性核糖體P蛋白還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、細胞凋亡以及許多疾病有關(guān)[12,13]。

ROS是氧的某些代謝產(chǎn)物和一些反應(yīng)的含氧自由基，在生理狀態(tài)下，機體產(chǎn)生的自由基與抗氧化防御系統(tǒng)處于相對平衡。在病理狀態(tài)下，機體產(chǎn)生大量自由基，會造成細胞結(jié)構(gòu)和功能破壞。KTZ能增加人肝細胞的胞內(nèi)ROS，從而誘導(dǎo)人肝細胞凋亡。腺苷酸激酶2(adenylate kinase 2，AK2) 是位于線粒體內(nèi)膜中的腺苷酸激酶亞型，其mRNA在肝臟、心臟、骨骼肌和胰腺中含量較高，在腎臟、胎盤和大腦中略少。但是，AK2蛋白在肝臟、腎臟和心臟中高表達，在肺和骨骼肌中低表達。該酶在線粒體中的定位表明其在細胞增殖和凋亡的能量需求中起重要作用。在凋亡過程中，AK2能與Fas相關(guān)死亡域蛋白和caspase-10結(jié)合形成復(fù)合物從而激活一種新的細胞凋亡通路，但其具體機制仍不清楚[14]。

Ras GPT酶活化蛋白結(jié)合蛋白1 (ras GTPase-activating protein-binding protein 1，G3BP1)具有結(jié)合ATP、DNA、mRNA和RNA的活性，具有依賴ATP的DNA和RNA解螺旋酶活性以及核酸內(nèi)切酶活性。有研究表明G3BP1能與HCV病毒的非功能區(qū)蛋白5B和反義鏈RNA的5′-相互作用，可能是 HCV復(fù)制復(fù)合物的一個組成部分[15]。本研究中Ras GPT酶活化蛋白結(jié)合蛋白1的上調(diào)可能與KTZ導(dǎo)致的細胞凋亡過程有關(guān)，具體機制仍待深入研究。

丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvate dehydrogenase complex，PDHc)主要由丙酮酸脫氫酶(E1)、二氫硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(E2)、二氫硫辛酸脫氫酶(E3)和一些輔助因子組成的多酶復(fù)合物，E1亞單位是由兩個α亞基和兩個β亞基組成的異構(gòu)四聚體。E1、E2和E3以首尾相連的形式將丙酮酸不可逆的氧化脫羧，將乙酰基轉(zhuǎn)移給輔酶A，從而形成重要的物質(zhì)乙酰輔酶A，在細胞線粒體呼吸鏈能量代謝中起重要作用。臨床上，丙酮酸脫氫酶E1α亞基突變或者磷酸化是丙酮酸脫氫酶缺乏的主要原因，也是兒童乳酸酸中毒和早發(fā)性、退行性、神經(jīng)變性病的最常見的病因。此外，在兩個病例中發(fā)現(xiàn)由E1β亞基缺陷導(dǎo)致的乳酸酸中毒和肌張力低下[16]。 本研究中細胞毒性發(fā)生時，E1 α亞基和 β亞基表達均增強，可能與細胞呼吸鏈能量代謝變化有關(guān)。

血紅素是血紅蛋白和其他血紅素蛋白的輔基，當血紅素蛋白降解時，血紅素幾乎轉(zhuǎn)變成膽紅素和一氧化碳。這一轉(zhuǎn)變過程是由血紅素加氧酶和膽綠素還原酶(biliverdin Ⅸ alpha reductase)催化完成。膽綠素還原酶是一種胞質(zhì)酶，哺乳動物的膽綠素還原酶的相對分子質(zhì)量約為34000，且為單體分子。在NAD(P)H存在時，膽綠素還原酶能將膽綠素IXα還原成膽紅素Ixα[17]。肝細胞毒性發(fā)生時膽綠素還原酶下調(diào)，可能與細胞凋亡過程有關(guān)。

本研究用蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定出與細胞毒性相關(guān)的上調(diào)蛋白4個，下調(diào)蛋白3個，提示KTZ誘導(dǎo)細胞毒性發(fā)生時，細胞內(nèi)發(fā)生了一系列復(fù)雜的變化，包括基因表達變化、能量代謝變化和血紅素代謝變化。這些差異性蛋白可能在藥物毒性誘導(dǎo)的肝細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，這也是KTZ細胞毒性機制研究的重要方向。