西蘭花種子中黑芥子酶酶解性質(zhì)及其應(yīng)用研究

侯海亮, 鄧 莉, 楊 黽, 劉 娜

(1.天津春發(fā)生物科技集團(tuán)有限公司 研發(fā)中心, 天津 300399;2.天津市風(fēng)味食品配料企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300399)

黑芥子苷/黑芥子酶體系是十字花科植物中普遍存在的酶促反應(yīng)體系。該體系產(chǎn)生的異硫氰酸酯鹽，不但具有驅(qū)蟲、殺蟲及抑制土壤微生物的功效[1-4]，還具有防癌[5-7]和抗菌[8-11]等功效，擁有廣闊的市場前景。大多研究者研究的是黑芥子酶的藥用價(jià)值[12-15]，對(duì)黑芥子酶在食品催化方面的應(yīng)用鮮有報(bào)道。本文對(duì)黑芥子酶在催化脫水蔬菜方面的應(yīng)用進(jìn)行了初步研究，旨在為黑芥子酶在食品方面的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考。

受保存時(shí)間過長或加熱等多方面因素影響，生蔬菜、脫水蔬菜及熟制蔬菜等菜品會(huì)損失很多異硫氰酸酯類物質(zhì)，進(jìn)而失去原有的獨(dú)特風(fēng)味。這是因?yàn)?，蔬菜的?nèi)源黑芥子酶容易在保存的過程中失活，不能進(jìn)一步催化食品中黑芥子苷轉(zhuǎn)化成具有特殊風(fēng)味的異硫氰酸酯類物質(zhì)。不同的十字花科植物擁有不同種類、不同含量的異硫氰酸鹽，若應(yīng)用某種異硫氰酸酯類物質(zhì)對(duì)菜品進(jìn)行調(diào)香，會(huì)產(chǎn)生明顯的不和諧風(fēng)味。黑芥子酶的酶活性、種類及數(shù)量對(duì)異硫氰酸酯的生成量均會(huì)產(chǎn)生很大的影響，黑芥子酶活性受pH值、溫度等多種因素的制約[16]。本研究擬采用天然植物西蘭花種子中的內(nèi)源酶作為天然酶，催化蔬菜中黑芥子苷生成異硫氰酸酯類等特殊風(fēng)味物質(zhì)。該方法可以使十字花科的生蔬菜、脫水蔬菜及熟制蔬菜散發(fā)出特有的香氣。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花種子、油菜籽餅粕及蔬菜皆購自農(nóng)貿(mào)市場；脫水蔬菜為興化市福味食品有限公司生產(chǎn)；二氯甲烷、石油醚、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸等試劑均為分析純，購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；異硫氰酸烯丙酯(分析純)，購自Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HP1200型高效液相色譜、6890N GC-5975 MSD型氣相色譜- 質(zhì)譜儀，安捷倫科技(中國)有限公司；85- 2型磁力攪拌器，天津市華儀鑫達(dá)儀器儀表有限公司；DZF- 6020型恒溫真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PL403型電子天平、FiveEasy Plus型pH檢測器，梅特勒- 托利多(常州)精密儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1粗黑芥子酶提取物的制備

將西蘭花種子用研缽磨碎、過篩，轉(zhuǎn)移至燒瓶。在燒瓶中倒入一定量的石油醚，使石油醚剛好浸過種子粉。過夜脫脂，反復(fù)進(jìn)行3次。將脫脂后的西蘭花種子放入恒溫真空干燥箱中，20 ℃下?lián)]去石油醚，即可得到粗黑芥子酶的提取物。

1.3.2異硫氰酸烯丙酯含量的測量

取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用pH值為7的磷酸二氫鉀- 磷酸緩沖溶液定容至100 mL，取樣量為10 μL，液相色譜柱采用Agilent Eclipse XDB- C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=60∶40；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測波長247 nm[17]。進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3黑芥子酶酶活性測定

準(zhǔn)確稱取100 mg粗黑芥子酶提取物樣品，油菜籽餅粕1 g，加入20 mL pH值為7的磷酸氫二鉀- 磷酸緩沖溶液， 40 ℃磁力攪拌酶解2 h，再加入2 mL二氯甲烷萃取。將離心管5 000 r·min-1條件下離心5 min，取10 μL二氯甲烷清液過濾，進(jìn)樣檢測。采用1.3.2中檢測異硫氰酸烯丙酯的方法測定由酶解生成的異硫氰酸烯丙酯的含量。

黑芥子酶活的定義為40 ℃、pH值為7的條件下，單位時(shí)間(h)轉(zhuǎn)化催化1 μmolβ-硫代葡萄糖苷所需要的酶量，為1 U。黑芥子酶酶比活力定義為單位質(zhì)量(mg)粗酶提取物中，在單位時(shí)間(h)轉(zhuǎn)化催化1 μmolβ-硫代葡萄糖苷所需要的酶量，為1 U/mg。

1.3.4西蘭花黑芥子酶催化實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g某種蔬菜及0.1 g 100目西蘭花種子粉放置于西林瓶中，再加入10 mL水密封，作為2號(hào)瓶。1號(hào)瓶為只有等量的種子粉末及蒸餾水的對(duì)照組，3號(hào)瓶為只有等量的蔬菜及蒸餾水的對(duì)照組。同一條件下，檢測揮發(fā)性物質(zhì)的含量，對(duì)比參照是否有含量變化。吸附完成后打開瓶蓋，評(píng)香員進(jìn)行感官評(píng)價(jià)、打分。

1.3.5揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

1)氣相色譜條件：載氣為He，不分流，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣口處的溫度為250 ℃，程序升溫模式，起始溫度為40 ℃，保持8 min。以5 ℃·min-1的速率加熱氣相色譜柱，上升至140 ℃，保持3 min；再以10 ℃·min-1的速率加熱氣相色譜柱，上升至250 ℃。

2)質(zhì)譜條件：全掃描模式，EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z為35～500 u，無溶劑延遲。

3)固相微萃取條件：于50 ℃磁力攪拌器上吸附40 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同因素對(duì)黑芥子酶活性的影響

2.1.1不同品種西蘭花種子對(duì)黑芥子酶活性的影響

在溫度為40 ℃，pH值為7的緩沖溶液實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同品種的西蘭花種子黑芥子酶酶活性測量，結(jié)果見表1。由表1可以看出，成熟期為早中熟的西蘭花種子在40 ℃時(shí)酶活性最高，酶比活力為40 U·mg-1左右；中熟型與中晚熟型的酶活性其次，為31～33 U·mg-1；晚熟型西蘭苔1號(hào)(西蘭苔)酶比活力為25 U·mg-1。

表1 10種西蘭花種子的酶活性差異Tab.1 Differences of myrosinase activity from 10 broccoli seeds

2.1.2溫度對(duì)黑芥子酶活性的影響

選取4種不同成熟期類型的西蘭花種子，在pH值為7，不同溫度下對(duì)黑芥子酶的酶活性進(jìn)行檢測，將結(jié)果繪制成圖1。由圖1可見，不同品種間的酶活性差異較大：文興、炎秀種子在50～60 ℃時(shí)，黑芥子酶酶活性最高；西蘭苔種子則在55～65 ℃時(shí)黑芥子酶酶活性最高；碧玉種子則在50～55 ℃時(shí)黑芥子酶酶活性最高，但整體差異不大。這4種西蘭花種子在50～65 ℃時(shí)均能體現(xiàn)出很好的催化效率，其中有兩種西蘭花種子在55 ℃時(shí)催化效率最高。

圖1 溫度對(duì)不同品種西蘭花種子中黑芥子酶活性的影響Fig.1 Effects of temperature on myrosinase activity in different kinds of broccoli seeds

2.1.3pH值對(duì)黑芥子酶活性的影響

選取文興、西蘭苔、炎秀及碧玉4種西蘭花種子作為黑芥子酶的供體，采用磷酸氫二鉀- 磷酸的緩沖溶液，選擇pH值為4、5、6、7、8、9六個(gè)值為測試點(diǎn)，選擇50 ℃作為酶解溫度，對(duì)黑芥子酶的酶活性進(jìn)行測量，結(jié)果見圖2。由圖2可知，不同pH值，酶活性差異較大。碧玉、炎秀種子中黑芥子酶最適pH值為5～7；文興、西蘭苔種子酶活性最高時(shí)的pH值為6～8。在pH值為6時(shí)，碧玉西蘭花中的黑芥子酶酶活性最高，其次才是文興西蘭花，但是碧玉西蘭花的酶活性較高的位置在弱酸環(huán)境，而文興和西蘭苔兩種西蘭花的黑芥子酶酶活性最高區(qū)域則在酸堿中性附近。

圖2 pH值對(duì)不同品種西蘭花種子中黑芥子酶活性的影響Fig.2 Effects of pH on myrosinase activity in different kinds of broccoli seeds

2.1.4保存狀態(tài)對(duì)黑芥子酶活性的影響

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)對(duì)比，選取酶活性最高、酸堿適應(yīng)性最強(qiáng)的文興西蘭花種子做保存狀態(tài)對(duì)黑芥子酶影響的實(shí)驗(yàn)。由于測量酶活性的目的是應(yīng)用于可食用的菜品，所以需要考慮使用方法、食品安全及保質(zhì)期長短3個(gè)方面的因素。西蘭花種子需粉碎篩選后進(jìn)行酶活性測試，作為對(duì)照組；脫脂前與脫脂后的種子粉末作為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行長達(dá)一年的跟蹤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3。由圖3可見，脫脂之后的酶比活力比未脫脂及種子的酶比活力要高，可能是因?yàn)閱挝毁|(zhì)量的酶的數(shù)量較多，使得酶比活力較高。隨著時(shí)間的變化脫脂的種子粉末酶比活力會(huì)降低，而沒有粉碎的種子及未進(jìn)行脫脂的種子的酶比活力隨著時(shí)間的變化不大。因?yàn)槊撝^程采用石油醚，操作比較繁瑣且有殘留；而未粉碎的種子不能直接食用，所以粉碎后篩選未進(jìn)行脫脂的種子粉末才能作為天然無污染的外源酶，對(duì)食品進(jìn)行風(fēng)味改良。

圖3 不同狀態(tài)下的文興西蘭花種子酶活性變化趨勢Fig.3 Change trends of myrosinase activity in Wenxingbroccoli seeds at different state

2.2 西蘭花黑芥子酶催化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)對(duì)比及2.1的結(jié)果分析，優(yōu)選出未脫脂的文興西蘭花種子進(jìn)行蔬菜的香氣催化實(shí)驗(yàn)。以脫水甘藍(lán)菜為例，直接按照實(shí)驗(yàn)1.3.4進(jìn)行固相微萃取操作，然后進(jìn)行GC/MS檢測，結(jié)果見圖4。由圖4可見，反應(yīng)前后4-甲硫基戊腈峰面積基本不變。以4-甲硫基戊腈為參照可以看出，反應(yīng)后的異硫氰酸脂類比例明顯升高，峰面積明顯增大，尤其是異硫氰酸烯丙酯的含量迅速增加。按峰面積粗略估計(jì)，增大的比例約為400%，相比之下，種子粉末對(duì)照組的峰面積幾乎為0。感官評(píng)價(jià)結(jié)果中，只有種子的1號(hào)瓶氣味很小，可忽略不計(jì)，設(shè)定3號(hào)瓶值為6.5。以1號(hào)瓶及3號(hào)瓶的值為參考，對(duì)2號(hào)瓶的香氣進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1. 2號(hào)瓶中異硫氰酸酯；2. 3號(hào)瓶中異硫氰酸酯；3. 3號(hào)瓶中4-甲硫基戊腈；4. 2號(hào)瓶中4-甲硫基戊腈。圖4 文興西蘭花種子催化脫水甘藍(lán)菜實(shí)驗(yàn)SPME- GC- MS分析結(jié)果Fig.4 Results of SPME- GC- MS detection on catalytic dehydrated cabbage by Wenxing broccoli seeds

除了對(duì)脫水甘藍(lán)菜進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析之外，對(duì)其他的脫水蔬菜、新鮮蔬菜及熟制蔬菜也進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn)分析，測定結(jié)果見表2。由表2可知，脫水的十字花科蔬菜復(fù)水之后，再經(jīng)過文興西蘭花種子的催化，其特征性的氣味恢復(fù)很大，評(píng)香員一致認(rèn)為濃度過高，產(chǎn)生了 “菜臭味”。炒白菜、炒西葫蘆是家常菜品，在家常菜品的基礎(chǔ)上仍舊能夠恢復(fù)原有菜品的菜香。表2中的普通蔬菜不僅包括十字花科的蔬菜，還包括部分菊科、藜科、百合科蔬菜。西蘭花種子也能夠恢復(fù)這些蔬菜原有的味道。

表2 文興西蘭花種子催化不同蔬菜的感官評(píng)價(jià) 結(jié)果及檢測結(jié)果Tab.2 Results of sensory evaluation and GC/MS detection on different vegetables catalyzed by Wenxing broccoli seeds

3 結(jié) 論

西蘭花種子作為天然植物的種子，擁有催化硫苷形成異硫氰酸酯等眾多風(fēng)味的天然酶。本研究探討了不同品種西蘭花種子的黑芥子酶比活力，并通過一系列實(shí)驗(yàn)測出了黑芥子酶催化硫苷形成異硫氰酸酯的最適溫度范圍為50～65 ℃，pH值為5～8。優(yōu)選出在弱酸、中性與弱堿環(huán)境中均能體現(xiàn)出良好催化作用的文興西蘭花種子，并在50 ℃ 水中，采用該種子粉碎篩分之后的種子粉末對(duì)10種蔬菜進(jìn)行香氣恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：該種子粉末不僅能刺激新鮮蔬菜散發(fā)更多的特征性氣味，還能在很大程度上恢復(fù)脫水蔬菜(如脫水甘藍(lán)菜、脫水白菜、脫水菜心)及熟制蔬菜(如炒白菜、炒西葫蘆)的天然香味。除十字花科蔬菜之外，又嘗試了對(duì)其他科蔬菜的催化實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，文興西蘭花種子粉末不但能刺激十字花科的蔬菜產(chǎn)生菜香，還能刺激其他科的部分蔬菜產(chǎn)生天然菜香。本研究表明，通過加入外源的天然黑芥子酶使菜品恢復(fù)原有的風(fēng)味，可以解決部分蔬菜的風(fēng)味損失問題，開拓了黑芥子酶在新領(lǐng)域的應(yīng)用研究，為黑芥子酶在食品方面的應(yīng)用提供了一個(gè)新的參考方法。