一株小脆柄菇的分離培養(yǎng)及木質(zhì)素降解酶活性

劉子璐，胡渤洋，王文平，陳青君，孫 悅，張 嬌，張國(guó)慶*

(北京農(nóng)學(xué)院a.生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/北京林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心，農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

白腐真菌(White rot fungi)是一類(lèi)能夠降解木材并造成白色腐朽的真菌，它們能夠分泌多種降解木質(zhì)纖維素的胞外酶，且降解木質(zhì)素能力強(qiáng)于降解纖維素的能力[1]。白腐真菌作為木質(zhì)纖維素分解者，在自然界碳循環(huán)中扮演著極其重要的作用，它們的木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)(Ligninolytic enzyme system)主要包括3種酶：錳過(guò)氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP)、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lignin peroxidase, LiP)和漆酶(Laccase, Lac)，它們共同作用將木質(zhì)素最終降解為二氧化碳和水。由于它們能夠降解芳香、雜環(huán)類(lèi)化合物，目前已在造紙、堆肥、環(huán)保等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[2-4]。

白黃小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)，又稱黃蓋小脆柄菇、垂幕菇、薄花邊傘等，是小脆柄菇屬常見(jiàn)種之一，常見(jiàn)于林中地上、草地、路旁或腐木等，群生或近叢生，可食用，分布于亞洲、歐洲、北美等地區(qū)[5]。傅愷等利用白黃小脆柄菇進(jìn)行液體深層發(fā)酵獲得胞外漆酶，產(chǎn)量達(dá)到9 100 IU/L[6]。李學(xué)梅等從白黃小脆柄菇發(fā)酵液提取物中分離到一種新的血莧烷型倍半萜[7]。該研究前期從北京農(nóng)學(xué)院校園內(nèi)采集并分離的一株小脆柄菇屬真菌，菌絲體未測(cè)得漆酶活性，與前人文獻(xiàn)報(bào)道不同，可能具有不同的木質(zhì)素降解酶系。因此，擬開(kāi)展菌株分類(lèi)鑒定、菌絲體培養(yǎng)條件以及木質(zhì)素降解酶活性測(cè)定研究，明確其木質(zhì)素降解酶系，為其開(kāi)發(fā)利用奠定理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

小脆柄菇子實(shí)體采集自北京農(nóng)學(xué)院，由生物與資源環(huán)境學(xué)院食藥用菌課題組分離與保藏。

菌株分離與保藏利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。液體發(fā)酵利用馬鈴薯葡萄糖(PD)培養(yǎng)基，液體發(fā)酵使用250 mL錐形瓶，每瓶裝50 mL培養(yǎng)基。菌絲最適培養(yǎng)條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基參考王壽南等的報(bào)道[8]。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分離、培養(yǎng)與保存 菌株分離采用組織分離法[8]。菌株編號(hào)為F1734，于25 ℃避光培養(yǎng)7 d，于4 ℃保藏。

1.2.2 形態(tài)與分子鑒定 觀察子實(shí)體形態(tài)并記錄。菌絲顯微觀察采用插片培養(yǎng)法。分子鑒定采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)鑒定法，引物為通用引物ITS1和ITS4。目的序列比對(duì)采用BLAST在線比對(duì)分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，利用MEGA 7.0軟件、采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定目標(biāo)菌株的分類(lèi)學(xué)地位[8]。

1.2.4 液體發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)素降解酶活性 以新鮮的F1734菌餅接種于PDA平皿(9 cm)上，25 ℃避光培養(yǎng)至剛剛長(zhǎng)滿平皿，無(wú)菌條件下將其轉(zhuǎn)移至無(wú)菌組織勻漿器中，加入50 mL 無(wú)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，充分勻漿，制成種子液，以5%(V/V)的接種量將種子液添加到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。在接種第3至第9天隨機(jī)取3瓶，4 ℃、8 000 r/min、30 min離心，將菌絲體和上清液分離。菌絲體于35 ℃烘2 h、55 ℃烘至恒重，測(cè)量干重。取上清液分別測(cè)定胞外Lac、MnP和LiP酶活。Lac活性測(cè)定采用2,2’-連氮-雙-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)法[9]。酶活單位(Unit, U)定義為：在420 nm處，每1 min催化1 μmol ABTS生成產(chǎn)物所需的酶量[10]。MnP活性測(cè)定采用MnSO4作為底物。酶活單位定義為：在240 nm處，每1 min催化1 μmol Mn2+轉(zhuǎn)化為Mn3+所需的酶量[11]。LiP酶活性測(cè)定采用藜蘆醇作為底物。酶活單位定義為：在310 nm處，每1 min催化1 μmol藜蘆醇轉(zhuǎn)化為藜蘆醛所需的酶量[12]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理和分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，對(duì)不同處理進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05代表數(shù)據(jù)存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征鑒定結(jié)果

F1734菌株子實(shí)體形態(tài)如圖1-A所示。其子實(shí)體發(fā)生于道路旁腐木落葉層、群生，子實(shí)體小至中型，菌蓋幼嫩時(shí)圓錐形、成熟后平展，初期邊緣附有白色菌幕殘片、后漸脫落，菌蓋邊緣污白至米黃色、中央黃褐色，菌褶直生、密、不等長(zhǎng)、污白、灰白至深紫褐色，菌柄細(xì)長(zhǎng)、中生、中空、質(zhì)地極脆、表面具白色纖毛，白色至污白色。其子實(shí)體形態(tài)特征與前人報(bào)道白黃小脆柄菇一致[13]。純培養(yǎng)菌落形態(tài)如圖1-B所示，菌落白色、不產(chǎn)色素，菌絲致密濃白。菌絲顯微形態(tài)如圖1-C所示，營(yíng)養(yǎng)菌絲無(wú)色透明，薄壁，有隔，多核，偶見(jiàn)鎖狀聯(lián)合。

A.子實(shí)體；B.菌落；C.菌絲體圖1 F1734菌株形態(tài)特征A. Fruiting body; B. Colony;C. MyceliaFig.1 Morphological characteristics of F1734 strain

2.2 分子鑒定結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得F1734菌株ITS序列片段，經(jīng)測(cè)序獲得長(zhǎng)度為695 bp的目的序列片段。利用Blast在線比對(duì)確定其為小脆柄菇屬。以小脆柄菇屬相近種、利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，F(xiàn)1734菌株與白黃小脆柄菇(P.candolleana)(EU622272.1)的相似性最高，為99%，遺傳距離為0.008。結(jié)合形態(tài)和分子鑒定，確定F1734菌株為白黃小脆柄菇。

圖2 基于ITS序列的F1734菌株與相近屬真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Polymeric analysis of strain F1734 and other strains from closegenera based on ITS sequences

2.3 最適培養(yǎng)條件

F1734菌株在蔗糖、淀粉等7種碳源及無(wú)碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CK)上均能生長(zhǎng)(表1)，菌落均為白色，無(wú)色素產(chǎn)生。菌絲在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最快(1.52 ± 0.03)mm/d，但長(zhǎng)勢(shì)較濃密，菌落產(chǎn)生絮狀氣生菌絲及同心圓結(jié)構(gòu)。菌絲在麥芽糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率為(1.34 ± 0.03) mm/d，長(zhǎng)勢(shì)最佳，菌落致密、濃白、均一，無(wú)同心圓結(jié)構(gòu)。菌絲在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最弱，表明F1734菌株纖維素酶活性較低。綜合菌絲生長(zhǎng)速率和菌絲長(zhǎng)勢(shì)，F(xiàn)1734菌絲體最適碳源為麥芽糖。

表1 不同碳源、氮源和C/N比對(duì)F1734菌株菌絲體生長(zhǎng)的影響

Tab.1 Effect of carbon, nitrogen, and C/N ratioon mycelial growth of strain F1734

生長(zhǎng)因子GrowthFactor菌絲生長(zhǎng)速率v/(mm/d)Mycelial growth rate菌絲長(zhǎng)勢(shì)Mycelial growthC源Carbon source蔗糖Sucrose1.52 ± 0.03 a+ +淀粉Starch1.41 ± 0.00 b+ +山梨醇Sorbitol1.39 ± 0.04 bc+ +對(duì)照CTL1.39 ± 0.02 bc+ +麥芽糖Maltose1.34 ± 0.03 cd+ + +羧甲基纖維素鈉Carboxymethylcellulose sodium1.29 ± 0.06 de+葡萄糖Glucose1.28 ± 0.05 e+ +乳糖Lactose1.12 ± 0.01 f+ +N源Nitrogen sourse尿素Urea4.67 ± 0.24 a+ +胰蛋白胨Casein tryptone4.09 ± 0.20 b+ + +酵母浸粉Yeast extract3.66 ± 0.17 c+ +黃豆粉Soybean meal3.38 ± 0.23 c+對(duì)照CTL3.31 ± 0.23 c—牛肉膏Beef extract2.49 ± 0.05 d+ +硫酸銨Ammonium sulfate0.98 ± 0.20 f+C/N比C/N ratio10/14.35 ± 0.06 a+ + +40/14.09 ± 0.08 b+ + +20/14.08 ± 0.10 b+ + +30/14.03 ± 0.08 bc+ + +60/13.92 ± 0.03 c+ + +50/13.26 ± 0.03 d+ + +10/14.35 ± 0.06 a+ + +

—：不生長(zhǎng)；+：生長(zhǎng)稀疏；+ +：生長(zhǎng)較致密；+ + +：生長(zhǎng)旺盛。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P< 0.05)

—:No mycelia growth; +: mycelial growth weak; + +: mycelial growth ordinary; + + +: mycelial growth strong. Different small letters indicate significant differences (P< 0.05)

圖3 溫度和pH對(duì)F1734菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of temperatureandpHon mycelial growth of strain F1734

F1734菌株在尿素、胰蛋白胨等6種氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)(表1)。而在無(wú)氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CK)上幾乎不生長(zhǎng)，除硫酸銨培養(yǎng)基外，菌落均為白色，無(wú)色素產(chǎn)生。菌絲在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最快(4.67 ± 0.24) mm/d，其次是胰蛋白胨(4.09 ± 0.20) mm/d，但后者菌絲長(zhǎng)勢(shì)最佳，菌絲濃白。在硫酸銨的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最慢(0.98 ± 0.20) mm/d，長(zhǎng)勢(shì)最弱，菌落邊際不均一，且分泌黃色色素。綜合菌絲生長(zhǎng)速率及菌絲長(zhǎng)勢(shì)，F(xiàn)1734菌絲生長(zhǎng)最適氮源為胰蛋白胨。

F1734菌株在C/N比10/1至60/1范圍均能生長(zhǎng)良好(表1)，菌絲致密濃白。菌絲在C/N比為10/1培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最快(4.35 ± 0.06) mm/d，其次為40/1培養(yǎng)基(4.09 ± 0.08) mm/d，在50/1培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最慢(3.26 ± 0.03) mm/d。綜合菌絲生長(zhǎng)速率及菌絲長(zhǎng)勢(shì)，F(xiàn)1734菌絲生長(zhǎng)的最適C/N比為10/1。

F1734菌株在20～32 ℃下均能生長(zhǎng)，在37 ℃時(shí)無(wú)法生長(zhǎng)(圖3-A)，菌落白色。20 ℃培養(yǎng)時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率較快，但菌絲長(zhǎng)勢(shì)較25～30 ℃培養(yǎng)時(shí)稍弱；菌株在25～30 ℃培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速率最快(3.75 ± 0.07)～(3.98 ± 0.06) mm/d，菌絲濃白致密。當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率下降、長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酰?2 ℃培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速率僅為(1.09 ± 0.11) mm/d。而當(dāng)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，菌株無(wú)法生長(zhǎng)。綜合菌絲生長(zhǎng)速率及菌絲長(zhǎng)勢(shì)，F(xiàn)1734菌絲體生長(zhǎng)最適溫度范圍為25～30 ℃。

F1734菌株在pH 6.0～11.0時(shí)均能生長(zhǎng)，在pH 7.0～9.0時(shí)生長(zhǎng)速率最快、長(zhǎng)勢(shì)最佳，而當(dāng)pH低于7.0或高于9.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率迅速下降(圖3-B)。pH 7.0～9.0時(shí)生長(zhǎng)速率最快(3.99 ± 0.06)～(4.10 ± 0.05) mm/d，菌絲致密濃白；而pH 5.0時(shí)生長(zhǎng)速率最慢(0.80 ± 0.02) mm/d，長(zhǎng)勢(shì)最弱，且菌落形狀不規(guī)則。綜合菌絲生長(zhǎng)速率和菌絲長(zhǎng)勢(shì)，F(xiàn)1734菌絲體生長(zhǎng)最適pH值在7.0～9.0之間。

2.4 液體發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)素降解酶活性

F1734菌株液體發(fā)酵時(shí)，在第3～7天呈線性生長(zhǎng)，在第7天菌絲干重達(dá)到最大，50 mL發(fā)酵液中菌絲干重達(dá)到(25.63 ± 5.12) mg，在7～9 d菌絲生物量保持相對(duì)穩(wěn)定(圖4-A、圖4-B～D)。F1734菌株液體發(fā)酵產(chǎn)Lac、MnP和LiP結(jié)果如圖4-B～D所示。在發(fā)酵培養(yǎng)的第3～9天，發(fā)酵液中均未檢測(cè)出Lac活性，表明該條件下F1734菌株無(wú)胞外漆酶活性(圖4-B)。MnP酶活在第4天開(kāi)始出現(xiàn)，隨后逐漸增加，在第7天時(shí)達(dá)到峰值，為(186.32±7.29) U/mL，隨后迅速下降(圖4-C)。LiP在第3天時(shí)表現(xiàn)出較高的活性，達(dá)到(3 787.90±283.43) U/mL，后緩慢上升，在第5天時(shí)酶活達(dá)到最高，為(4 890.20±979.37) U/mL，隨后在第5～7天時(shí)逐漸下降，在7～9 d酶活達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定，為(2 823.18 ～3 106.33) U/mL(圖4-D)。

A.生物量；B.漆酶；C.錳過(guò)氧化物酶；D.木質(zhì)素過(guò)氧化物酶圖4 F1734菌株液體發(fā)酵生物量與木質(zhì)素降解酶活性A. Biomass; B. Lac; C. MnP; D. LiPFig.4 Biomass and ligninolytic enzyme activities of during the liquid fermentation of strain F1734

3 討論與結(jié)論

白腐真菌對(duì)木質(zhì)素的降解主要依賴于一些胞外酶，這些酶共同構(gòu)成被稱之為木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)，主要包括Lac、MnP和LiP等，它們各有分工又協(xié)同合作，為白腐真菌的生物降解能力提供基礎(chǔ)[2]。根據(jù)這些木質(zhì)素降解酶在木質(zhì)素降解過(guò)程中扮演作用的不同，前人將白腐真菌分為三大類(lèi)，即LiP-MnP類(lèi)(LiP-MnP group)、MnP-Lac類(lèi)(MnP-Lac group)和LiP-Lac類(lèi)(LiP-Lac group)[14]。木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)研究最早也最為系統(tǒng)的是黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，它能夠分泌MnP和LiP，但不分泌Lac，屬于LiP-MnP類(lèi)；而紅平菇(Pleurotusdjamor)可同時(shí)產(chǎn)生MnP和Lac，但不產(chǎn)生LiP，則屬于MnP-Lac類(lèi)[14, 15]。該研究前期以小脆柄菇F1734菌株開(kāi)展產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌株能夠使愈創(chuàng)木酚平板變色，但不具有產(chǎn)漆酶活性，因而進(jìn)一步開(kāi)展了菌株鑒定、培養(yǎng)條件與液體發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)素降解酶研究，分析其木質(zhì)素降解酶系，為進(jìn)一步開(kāi)展該菌株木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)研究奠定基礎(chǔ)。

小脆柄菇屬(Psathyrella)真菌隸屬于擔(dān)子菌門(mén)(Basidomycota)傘菌綱(Agaricomycetes)傘菌目(Agaricales)脆柄菇科(Psathyrellaceae)，最初由Fries于1874年定義，模式種為褐白小脆柄菇(Psathyrellagracilis)[5]。小脆柄菇屬?gòu)V泛分布于世界各地，在中國(guó)各地區(qū)均有報(bào)道，世界范圍內(nèi)至少存在400～600種[13]。小脆柄菇屬真菌多發(fā)生于夏秋季節(jié)道旁、林緣、林中的腐木周?chē)安莸?、牧?chǎng)等，可以食用，能用于木質(zhì)素降解、制備香料等，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[16-18]。小脆柄菇通常具有濕潤(rùn)的菌蓋，菌蓋多呈圓錐形或鐘型或扁半球形、薄，顏色多為淺黃色或褐色。菌柄較長(zhǎng)，中空，彎曲狀。孢子印跡呈褐色甚至黑色和較為脆弱的擔(dān)子果等特點(diǎn)[5, 19]。由于小脆柄菇屬的菌株具有較脆弱的擔(dān)子和容易變色的濕潤(rùn)菌蓋，所以利用形態(tài)學(xué)特征對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)學(xué)鑒定具有較大的難度并且準(zhǔn)確度不高。

近些年來(lái)，分子技術(shù)已廣泛應(yīng)用于對(duì)其的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究[20]。王月等報(bào)道，該屬在中國(guó)26個(gè)省均有分布，包括51個(gè)種[5]。Yan等對(duì)中國(guó)東北的27個(gè)小脆柄菇屬菌株進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)了4個(gè)新種，分別是P.conica、P.jilinensis、P.mycenoides和P.subsingeri[21]。該研究通過(guò)形態(tài)學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)F1734菌株子實(shí)體形態(tài)符合前人對(duì)白黃小脆柄菇(P.candolleana)形態(tài)描述[5, 13]。另外，基于ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，F(xiàn)1734菌株與白黃小脆柄菇(EU622272.1)的相似性達(dá)到99%。因此，結(jié)合形態(tài)和分子鑒定，確定F1734菌株為白黃小脆柄菇。

對(duì)F1734菌株菌絲最適培養(yǎng)條件研究表明，該菌株最適碳源為麥芽糖，最適氮源為胰蛋白胨，最適C/N比為10/1，最適溫度范圍為25～30 ℃，最適pH值范圍為7.0～9.0。盡管白黃小脆柄菇屬于可食野生菌，其菌絲培養(yǎng)條件研究暫無(wú)相關(guān)報(bào)道，而前人對(duì)其相近屬鬼傘屬(Coprinus)培養(yǎng)條件研究較多。郝冊(cè)等報(bào)道，分離自北京市懷柔區(qū)寶山鎮(zhèn)的墨汁鬼傘(C.atramentarius)菌絲體生長(zhǎng)的最適碳源為葡萄糖+玉米淀粉、最適氮源為蛋白胨、最適pH值為9[22]。朱玉蘭等報(bào)道，分離自祁連山的毛頭鬼傘菌(C.comatus)菌絲生長(zhǎng)的最適碳源為蔗糖、最適氮源為酵母粉、最適溫度為24～26 ℃、最適pH為7.0[23]。F1734菌株最適碳、氮源常見(jiàn)，最適溫度、最適pH溫和，有利于減少工業(yè)發(fā)酵條件下的菌絲培養(yǎng)的開(kāi)發(fā)成本。

在利用馬鈴薯浸提物、蔗糖的液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，F(xiàn)1734菌株具有胞外MnP和LiP活性，而缺乏Lac活性，表明該菌株屬于LiP-MnP類(lèi)白腐真菌。傅愷等報(bào)道，白黃小脆柄菇進(jìn)行液體深層發(fā)酵獲得胞外漆酶，產(chǎn)量達(dá)到9100 IU/L[6]。張麗等報(bào)道，分離自廣州地區(qū)亞熱帶闊葉林的白黃小脆柄菇發(fā)酵液中具有漆酶活性，在第3天達(dá)到高峰為31525 IU/L[24]。這表明，F(xiàn)1734菌株具有不同于這2個(gè)菌株的木質(zhì)素降解酶特性。前人報(bào)道中，白腐真菌產(chǎn)Lac和MnP類(lèi)型較多，而產(chǎn)LiP類(lèi)型較少[15]。本研究中，菌株表現(xiàn)出較高的LiP和MnP活性，其中MnP活性是絨毛栓孔菌(Trametespubescens)的20倍左右[11]、是紅平菇(P.djamor)的100倍[25]，LiP活性是紅平菇的20倍[26]，顯著高于前人研究結(jié)果。

綜上，該研究通過(guò)對(duì)采集得到的菌種進(jìn)行分離鑒定，獲得一株白黃小脆柄，并確定了菌絲培養(yǎng)條件，明確該菌株屬于LiP-MnP類(lèi)白腐真菌。同時(shí)也是首次對(duì)白黃小脆柄菇中的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶進(jìn)行了報(bào)道，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。