人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠的卵巢早衰

譚 麗，毛熙光，鐘 影，劉 敬

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，四川 瀘州 646000； 2.成都西囡婦科醫(yī)院生殖中心，成都 610000)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF) 是由于卵巢功能衰退而引起更年期綜合癥、性欲減退、不孕、月經(jīng)失調(diào)等癥狀疾病[1]。引起POF發(fā)生的可能因素有自身免疫損傷、精神刺激、代謝異常、環(huán)境破壞、手術(shù)損傷及吸煙、飲酒等不良生活方式[2-3]，但大部分POF患者的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確。目前POF的研究熱點(diǎn)是如何有效恢復(fù)患者的卵巢功能和生育力，而干細(xì)胞是一類(lèi)能自我更新的多潛能細(xì)胞，在一定條件下具有再生各種組織器官和人體的潛在功能。有研究表明，通過(guò)干細(xì)胞移植治療POF，在一定程度上能恢復(fù)卵巢組織形態(tài)、彈性和韌性，減少卵巢組織纖維化[4-5]。hUCMSCs移植目前在臨床上廣泛應(yīng)用于各種組織損傷的修復(fù)。本研究通過(guò)觀(guān)察POF大鼠移植hUCMSCs后的卵泡情況、卵巢超微結(jié)構(gòu)、血清中激素表達(dá)水平以及SOD1、UCP-2蛋白的變化，探討hUCMSCs修復(fù)卵巢功能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

具有正常動(dòng)情周期的SPF級(jí)SD雌性大鼠30只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[SCXK (京) 2018-0006]，體重 (200±20)g。大鼠統(tǒng)一飼養(yǎng)在我院動(dòng)物房[SCXK(川)2018-17]，室溫(22±2)℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，完全隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、模型組及hUMSCs移植組，每組10只。本研究通過(guò)了我院倫理委員會(huì)審查，實(shí)驗(yàn)過(guò)程動(dòng)物符合3R原則(倫理審批號(hào)：SLXD _201803170012)。

1.2 主要試劑與儀器

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)：20180412)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清 (FBS)、青/鏈霉素混合液和膠原酶IV型 (collagenase IV)均購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶科技有限公司；二步法免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AH03014880)；全蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；ELISA檢測(cè)試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司，批號(hào)CSB-E08008r)；SOD1、UCP-2和GAPDH抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔二抗購(gòu)自廣州展晨生物科技有限公司。美國(guó)Bio-Rad蛋白電泳儀和Western曝光儀；日本電子TECNA I型透射電鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的構(gòu)建

模型大鼠第1天腹腔注射負(fù)荷劑量的CTX溶液，即50 mg/kg溶于1 mL生理鹽水中，之后2～15 d連續(xù)每日以10 mg/kg CTX溶于1 mL生理鹽水腹腔注射；造模成功后，將模型大鼠隨機(jī)分為模型組和hUMSCs移植組，hUMSCs移植組在成功建模后1 d通過(guò)尾靜脈注射1 mL hUMSCs單細(xì)胞混懸液，移植細(xì)胞量約為1×106個(gè)，模型組注射等劑量的生理鹽水。

1.3.2 hUMSCs培養(yǎng)與鑒定

取正常足月產(chǎn)婦新生兒臍帶，PBS沖洗后，除去臍動(dòng)、靜脈殘留血，剔除血管。將臍帶剪碎至1.0～2.0 mm3大小，按胰蛋白酶消化法進(jìn)行培養(yǎng)[6]。取第3代hUCMSCs，采用流式細(xì)胞儀對(duì)其表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。試驗(yàn)方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與供者簽訂知情同意書(shū)。

1.3.3 標(biāo)本的采集

hUMSCs移植后17 d，對(duì)照組、模型組及hUCMSCs移植組大鼠主動(dòng)脈采血后，麻醉后，取仰臥位，迅速剖開(kāi)腹腔，摘取雙側(cè)卵巢組織，將一側(cè)卵巢組織以4% 多聚甲醛液固定24 h，脫水后石蠟包埋，用于HE染色及免疫組化檢測(cè)；另一側(cè)卵巢組織迅速切取一部分組織塊用于超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察，剩余部分立即置于液氮中過(guò)夜，并在第二天轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，備用。

1.3.4 大鼠卵泡情況

取石蠟包埋的卵巢組織，行6 μm厚連續(xù)切片，每隔10張取1張，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察卵泡的生長(zhǎng)情況和閉鎖情況，并對(duì)各組大鼠卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù)[7]。

1.3.5 大鼠卵巢組織超微結(jié)構(gòu)

取新鮮卵巢組織的切片，4℃下置3%戊二醛固定液固定24 h后，洗去固定液，置1%鋨酸固定液固定90 min，脫水、包埋、修塊，在超薄切片機(jī)上進(jìn)行切片，厚50 nm，采用醋酸鈾和枸櫞酸鉛對(duì)切片雙重染色，自然晾干后，置掃描電鏡下觀(guān)察。

1.3.6 血清E2、FSH、AMH、ROS、8-OHdG水平檢測(cè)

將采集的血樣室溫靜置，離心，分離血清，采用ELISA法檢測(cè)血清中E2、FSH、AMH、ROS、8-OHdG含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用酶標(biāo)儀在532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，計(jì)算即得。

1.3.7 卵巢組織免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)

石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，置于修復(fù)液中微波加熱修復(fù)，置于H2O2封閉，分別加入U(xiǎn)CP-2及SOD1一抗4℃ 孵育過(guò)夜，PBS沖洗8 min ×3次，加入二抗，37℃孵育2 h，PBS漂洗8 min ×3次，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀(guān)察。

1.3.8 Western blot檢測(cè)

在卵巢組織(50 mg)中加1 mL裂解液，冰上均漿，4℃離心10 min，經(jīng)BCA法蛋白定量后上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離、電泳、轉(zhuǎn)膜，采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h。加一抗，4℃冰箱過(guò)夜。加二抗37℃ 2 h，漂洗后顯影。對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析，測(cè)定其吸光度值。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=目的蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 hUMSCs鑒定定結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的結(jié)果顯示，hUMSCs高表達(dá)CD105、CD73，低表達(dá)CD34、CD45，證實(shí)為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞純度較好，見(jiàn)圖1。

2.2 病理學(xué)觀(guān)察結(jié)果

由圖2可知，對(duì)照組大鼠卵巢中各級(jí)卵泡均明顯可見(jiàn)，組織結(jié)構(gòu)正常。而與對(duì)照組相比，模型組卵巢體積變小，閉鎖卵泡數(shù)量增多、生長(zhǎng)卵泡減少。hUMSCs移植組與模型組比較閉鎖卵泡減少、生長(zhǎng)卵泡增多；各組大鼠卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果中，模型組與對(duì)照組比較閉鎖卵泡數(shù)量上升，而生長(zhǎng)卵泡數(shù)量下降(均P<0.05)。 hUMSCs移植組與模型組比較閉鎖卵泡數(shù)量下降，而生長(zhǎng)卵泡數(shù)量上升(均P<0.05)。各組大鼠黃體數(shù)量未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 卵巢超微結(jié)構(gòu)變化

大鼠卵巢電鏡觀(guān)察結(jié)果，對(duì)照組顆粒細(xì)胞無(wú)水腫，可見(jiàn)正常的細(xì)胞膜、核仁，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線(xiàn)粒體分布均勻、清晰可見(jiàn)，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻；模型組顆粒細(xì)胞染色質(zhì)固縮，核溶解，核膜消失，線(xiàn)粒體空泡化，細(xì)胞器數(shù)量減少，同時(shí)還出現(xiàn)有凋亡小體；移植組細(xì)胞核出現(xiàn)，核膜逐漸恢復(fù)，出現(xiàn)少量細(xì)胞器，詳見(jiàn)圖3。

2.4 血清檢測(cè)結(jié)果

ELISA檢測(cè)各組大鼠血清激素水平變化，模型組血清LH、FSH水平較對(duì)照組明顯升高 (均P<0.05)，而E2水平明顯降低 (P<0.05)；hUCMSCs移植組血清LH、FSH水平較模型組明顯下降 (均P<0.05)，而與對(duì)照組、模型組比較，hUCMSCs移植組E2水平明顯上升 (P<0.05)，見(jiàn)表2。

ELISA檢測(cè)ROS和8-OHdG結(jié)果，模型組、hUCMSCs移植組中ROS和8-OHdG生成量較對(duì)照組明顯增加 (均P<0.05)，而hUCMSCs移植組中ROS和8-OHdG生成量較模型組明顯下降 (P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖1 hUMSCs流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Changes of hUMSCs detected by flow cytometry

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。圖2 各組大鼠卵巢組織HE染色Note. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 2 Pathological changes in the ovarian tissues of rats in each group. HE staining

組別Groups生長(zhǎng)卵泡Growing follicles閉鎖卵泡Atretic follicle黃體Corpus luteum對(duì)照組Control group33.5±7.29.7±3.115.7±2.8模型組Model group20.4±7.3a20.6±5.9 a14.3±4.2hUMSCs移植組hUMSCs transplantation group29.3±2.9b12.1±1.9 b11.7±1.5

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

Note. Compared with the control group,aP< 0.05. Compared with the model group,bP< 0.05.

表2 各組大鼠血清激素水平變化

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

Note. Compared with the control group,aP< 0.05. Compared with the model group,bP< 0.05.

圖3 各組大鼠卵巢超微結(jié)構(gòu)(×8000)Figure 3 Ultrastructural changes of the ovary tissues of rats in each group

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。圖4 各組大鼠血清中8-OhdG和ROS含量變化(n=10)Note. Compared with the control group, aP < 0.05. Compared with the model group, bP < 0.05.Figure 4 Changes of serum 8-OhdG and ROS in the rats of each group

注：箭頭指陽(yáng)性細(xì)胞。圖5 免疫組化檢測(cè)各組大鼠卵巢中SOD1及UCP2蛋白表達(dá)Note. The arrow points to the positive cells.Figure 5 Expressions of SOD1 and UCP2 proteins in the rat ovarian tissues

2.5 各組大鼠卵巢免疫組化檢測(cè)

UCP-2蛋白主要位于黃體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞核和胞質(zhì)，而SOD1蛋白主要位于黃體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞胞質(zhì)。與對(duì)照組比較，模型組免疫組化UCP-2、SOD1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，而hUCMSCs移植組UCP-2、SOD1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組減少，見(jiàn)圖5。

2.6 Western blot檢測(cè)各組大鼠卵巢中SOD1及UCP2蛋白表達(dá)

模型組大鼠卵巢組織中SOD1、UCP-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加 (P<0.05)，經(jīng)過(guò)hUCMSCs移植治療后，SOD1、UCP-2蛋白水平較模型組明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。圖6 大鼠卵巢組織中SOD1及UCP2蛋白表達(dá)(n=10)Note. Compared with the control group, aP < 0.05. Compared with the model group, bP < 0.05.Figure 6 Expression of SOD1 and UCP2 in the rat ovarian tissues

3 討論

POF致病因素較多，發(fā)病率也逐漸升高，但目前尚無(wú)有效的恢復(fù)卵巢功能的治療方法，如何有效地治療是當(dāng)前亟需解決的難題之一。干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)界被稱(chēng)之為“萬(wàn)用細(xì)胞”，有研究表明，它們可能對(duì)卵巢功能有一定的修復(fù)作用[8]。hUCMSCs源于胎兒分娩后的廢棄物，來(lái)源豐富，體外培養(yǎng)及移植技術(shù)成熟，研究治療卵巢早衰方法已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外熱點(diǎn)。CTX是一種臨床常用于非特異性細(xì)胞周期的抗癌藥物，對(duì)卵巢會(huì)產(chǎn)生不可逆性的損傷[9]，進(jìn)而引發(fā)卵巢功能障礙，目前常用于POF造模。

本研究中，檢測(cè)卵巢生殖激素水平的結(jié)果顯示，hUCMSCs移植組中血清LH、FSH水平較模型組明顯下降，而與對(duì)照組、模型組比較，hUCMSCs移植組E2水平明顯上升，從而看出hUCMSCs移植后可以一定程度的改善卵巢功能。HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組閉鎖卵泡數(shù)量上升，生長(zhǎng)卵泡數(shù)量下降，而hUMSCs移植組閉鎖卵泡數(shù)量下降，生長(zhǎng)卵泡數(shù)量上升，這提示hUCMSCs移植后能夠通過(guò)減輕生長(zhǎng)卵泡的損傷發(fā)揮作用；大鼠卵巢電鏡觀(guān)察結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組顆粒細(xì)胞水腫，細(xì)胞核溶解，線(xiàn)粒體減少，出現(xiàn)凋亡小體等情況，而hUCMSCs移植后顆粒細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核，核膜逐漸恢復(fù)，出現(xiàn)少量細(xì)胞器，這說(shuō)明研究中模型大鼠采用的給藥方法和用藥劑量能產(chǎn)生卵巢損傷，而hUCMSCs對(duì)顆粒細(xì)胞有修復(fù)作用，研究人員推測(cè)hUCMSCs移植修復(fù)大鼠卵巢早衰機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)顆粒細(xì)胞修復(fù)從而抑制卵泡凋亡。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是生物體內(nèi)的自由基，具有很強(qiáng)的化學(xué)活性，線(xiàn)粒體是其來(lái)源和靶點(diǎn)，作為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的第二信使，ROS可調(diào)節(jié)許多信號(hào)分子，在維持機(jī)體氧化/抗氧化平衡方面起著重要作用[10-11]。本研究中大鼠經(jīng)CTX處理后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量ROS，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致大鼠線(xiàn)粒體受損，并可能誘發(fā)DNA/RNA氧化損傷，其中以8-OHdG最為常見(jiàn)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組中ROS和8-OHdG生成量較對(duì)照組明顯增加 (P<0.05)，推測(cè)原因是環(huán)磷酰胺處理后mtDNA改變和氧化應(yīng)激增加會(huì)引起線(xiàn)粒體功能降低，進(jìn)一步導(dǎo)致各種能量代謝的下降。

解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)屬于線(xiàn)粒體陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白超家族的一員，能夠介導(dǎo)線(xiàn)粒體的質(zhì)子漏[12]。有研究表明，UCP2在體內(nèi)可能參與了ROS生成的調(diào)控，并提出UCP2負(fù)調(diào)控的假設(shè)模型[13]，這一假說(shuō)表明UCP2可能在氧化應(yīng)激反應(yīng)中降低ROS水平，從而起到保護(hù)機(jī)體的過(guò)氧化損傷。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一種源于生命體的活性物質(zhì)，是機(jī)體氧自由基的頭號(hào)殺手，作為有害物質(zhì)的超氧陰離子在SOD的作用下和氫離子反應(yīng)生成H2O2，H2O2又在過(guò)氧化氫酶的作用下和氫反應(yīng)生成H2O，因此具有防止細(xì)胞和組織受到氧化性損傷的作用[14-15]。本研究中免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組UCP-2、SOD1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，而hUCMSCs移植組UCP-2、SOD1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組減少。同時(shí)Western blot檢測(cè)結(jié)果也顯示，模型組大鼠卵巢組織中SOD1、UCP-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，經(jīng)過(guò)hUCMSCs移植治療后，SOD1、UCP-2蛋白水平較模型組明顯下降，推測(cè)可能機(jī)制是UCP2通過(guò)解耦聯(lián)作用改變線(xiàn)粒體ROS合成，從而維持線(xiàn)粒體生物修復(fù)及ATP合成功能，同時(shí)hUCMSCs細(xì)胞移植后能改善氧化酶系統(tǒng)紊亂狀態(tài)，抗氧化酶SOD1使體內(nèi)的ROS變?yōu)榛钚暂^低的物質(zhì)，從而降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終保護(hù)卵巢線(xiàn)粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的作用。

本研究結(jié)果顯示，hUCMSCs治療后，能明顯修復(fù)卵巢的顆粒細(xì)胞，且SOD1和UCP-2表達(dá)水平以及ROS和8-OHDG生產(chǎn)量均有明顯降低，因此推測(cè)hUCMSCs移植修復(fù)POF大鼠卵巢功能的作用機(jī)制可能是hUCMSCs能夠降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高體內(nèi)卵巢線(xiàn)粒體功能，從而減輕CTX引起的卵巢損傷。