精神分裂癥模型大鼠前額葉皮質(zhì)PKA和內(nèi)皮細胞趨化因子-5的表達變化

萬爭艷，李 寧，向玲玲，陳 瑩，梅紅彬，董紅霞

(武漢市優(yōu)撫醫(yī)院，武漢 430023)

精神分裂癥是一種復(fù)雜的精神病，在精神分裂癥中，前額葉皮質(zhì)區(qū)域中功能和結(jié)構(gòu)受損，在背外側(cè)前額葉皮層最常見[1-2]。血腦屏障高度限制血液循環(huán)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的分子、離子和細胞的運動，以保護大腦[3]。據(jù)報道，各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括腦缺血性中風(fēng)、水腫、感染、癲癇、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病和帕金森病都與血腦屏障的分解有關(guān)[4-6]。環(huán)磷酸腺苷依賴蛋白激酶(cyclic adenosine monophosphate dependent protein kinase，PKA)依賴的方式激活內(nèi)皮細胞趨化因子-5(C-C motif ligand 5，CCL5)基因表達[7]。人和小鼠細胞質(zhì)末端結(jié)構(gòu)域中CCL5的磷酸化位點負責(zé)內(nèi)皮屏障對小分子的選擇性通透性增加[8]。與腦炎性病變相關(guān)的藥劑陣列表明，大量的效應(yīng)和反應(yīng)組合可能參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[9]。趨化因子是一組調(diào)節(jié)細胞結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)的分子，參與炎癥期間各種炎性細胞的表達，趨化因子通過與G蛋白偶聯(lián)受體的相互作用發(fā)出信號[10]。趨化因子活化正常T細胞表達和分泌，能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細胞中促炎介質(zhì)的合成，趨化因子刺激后，調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞啟動腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白細胞介素(interleukin，IL)-1，IL-17，巨噬細胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)-1α，MIP-1β，MIP-2的轉(zhuǎn)錄[11]。因此，在本研究中，筆者建立了精神分裂癥大鼠模型，觀察病理損傷和前額葉皮質(zhì)PKA和內(nèi)皮細胞趨化因子-5表達變化，闡明其神經(jīng)損傷機制，為指導(dǎo)臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

篩選30只6～8周齡的SPF 級250 g雄性SD大鼠(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心[SCXK-(軍)2017-0004][SYXK-(軍)2017-0004])飼養(yǎng)在帶有過濾器的籠子中，實驗前進行無差別飼養(yǎng)一周，動物設(shè)施和飼養(yǎng)符合動物保護原則。誘導(dǎo)7 d后麻醉舌下取血，處死后對腦部前額葉皮質(zhì)進行病理組織鏡檢。注：動物使用的倫理審批號IACUC為2017-0015；實驗過程中遵循3R原則。

1.2 實驗方法

1.2.1 精神分裂癥模型構(gòu)建

為了誘導(dǎo)精神分裂癥實驗大鼠，對誘導(dǎo)組大鼠每日腹腔注射苯丙胺0.5 mg/kg(濃度為0.1 mg/mL，給藥容量為5 uL/g)，連續(xù)7 d。對照組皮下注射生理鹽水。其他環(huán)境相同，建模時間持續(xù)7 d，期間記錄兩組大鼠的異常情況和死亡情況，本研究期間無大鼠自然死亡發(fā)生。

1.2.2 實驗分組

30只實驗大鼠隨機分為2組：對照組(為正常飼養(yǎng)大鼠，皮下注射生理鹽水，n=15)誘導(dǎo)組(每天皮下注射苯丙胺誘導(dǎo)腦部損傷建立精神分裂模型，n=15)[12]，兩組大鼠在37℃下籠中飼養(yǎng)。7 d后對實驗大鼠進行手術(shù)處理實驗。

1.2.3 通過行為學(xué)實驗檢測大鼠精神分裂模型的認知情況

首先對實驗中的兩組大鼠進行精神分裂模型檢測，確保后續(xù)實驗的準(zhǔn)確性。采用Sams-Dodd刻板行為評分系統(tǒng)對兩組大鼠進行行為學(xué)評分，根據(jù)大鼠的好動性和動態(tài)幅度大小在1～5分之間對大鼠行為進行打分計算；另外再用曠場實檢驗實驗大鼠精神分裂模型建模成功與否，在誘導(dǎo)組給藥7 d后，將誘導(dǎo)組和對照組放入約10 mm2的房間，地板劃分40個等大方格，在封閉無其他因素影響的條件下記錄兩組大鼠的活動情況，并記錄大鼠的活動的方格數(shù)，用大鼠穿越方格的數(shù)量來反映活動情況。兩個實驗分別單獨進行，且條件相同。

1.2.4 蘇木精-伊紅染色病理學(xué)觀察兩組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞核固縮陽性率[13]

麻醉處死大鼠后解剖取樣，將前額葉組織置于10%的福爾馬林溶液中，保持細胞原有形態(tài)。將修剪后的樣本置于包埋盒中沖洗0.5 h后用一定濃度梯度的酒精進行脫水處理，然后用石蠟包埋，切成5 μm厚度的切片，烘干后進行HE染色。使用明視場顯微鏡(Olympus BX61，日本Olympus公司)和掃描共聚焦激光顯微鏡(FV1000；日本Olympus公司)檢查所有樣品并拍照。通過待分析區(qū)域的組織切片的z軸收集10堆0.5 μm厚的光學(xué)切片顯微鏡下進行鏡檢觀察大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞核固縮陽性率情況，比對兩組大鼠細胞受損度。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗測定大鼠血液中的蛋白激酶A的含量

使用小鼠PKA酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒測定大鼠血液中的蛋白激酶A的含量。兩組實驗大鼠在空腹12個小時后進行麻醉舌下靜脈取血，處死后對大鼠腦補進行解剖留樣，用于后面病理切片觀察。應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或作為抗凝劑，然后加入10%(v/v)抗凝劑(0.1 mol/L檸檬酸鈉或1% heparin 或2.0% EDTA-Na2)混合大約15 min后，在(3000 r/min)離心機下離心20 min，收集樣本上清液。然后將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，加如樣品時時間控制在15 min內(nèi)。然后進行室溫溫育、洗滌。加入底物后定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化，避免反應(yīng)過強從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。利用小鼠(趨化因子/CCL5)試劑盒檢測兩組實驗大鼠中的CCL5水平含量。同檢測蛋白激酶A方法類似，靜脈舌下取血液樣本，經(jīng)過離心取樣、稀釋、加樣、溫育、洗滌等步驟，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸分析計算濃度。

1.2.6 凝膠電泳和Western印跡分析

同樣靜脈抽取兩組大鼠舌下血液樣本，然后離心稀釋，將離心樣本放置于100 μL緩沖液(50 mmol/L HEPES，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA， 1% Triton X-100，50 mmol/L氟化鈉，5 mmol/L焦磷酸鈉)中。 β-甘油磷酸鈉，1 mmol/L鄰釩酸鈉，1 mmol/L二硫蘇糖醇，1 mmol/L苯基甲磺酰氟，10 μg/ mL亮抑酶肽，10 μg/ mL抑肽酶)。通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce，Rockford，IL)測定全細胞提取物的含量。加入10μg樣品并在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離。轉(zhuǎn)移后對于Hybond ECL，硝酸纖維素膜(Amersham Pharmacia生物技術(shù)公司，美國)在4℃下用5%牛血清白蛋白封閉過夜處理，然后用指示的抗體探測。使用適當(dāng)?shù)拿庖咔虻鞍自噭┩ㄟ^增強化學(xué)發(fā)光(Amersham Pharmacia生物技術(shù)公司，美國)觀察印跡。

1.2.7 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

將1 μg經(jīng)DNA酶處理的RNA等分試樣與1 μL oligo dT引物(0.5 mg/mL)，1 μL 10 mm dNTP和ddH2O混合以均衡所有體積樣品濃度為12 μL。將混合物在65℃加熱5 min，在冰上淬滅并短暫旋轉(zhuǎn)，然后加入8 μL由4 μL 5×第一鏈緩沖液(Invitrogen)，2 μL 0.1 mol/L DTT組成的Master Mix，1 μL RNase抑制劑(Invitrogen公司，美國)和1 μL Superscript II(200 μL/μL，Invitrogen)。將反應(yīng)在42℃下孵育60 min，然后在70℃下孵育15 min，然后進行4℃浸泡。向每個樣品(在20 μL總體積中)中加入80 μL ddH2O。將5 μL稀釋的cDNA用于25 μL體積的每個PCR反應(yīng)，以下引物用于小鼠CCL5 cDNA和PKA的PCR擴增。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.8 RT-qPCR分析mRNA的表達

為了通過定量實時PCR(RT-qPCR)確定mRNA表達水平，根據(jù)制造商的方案,稀釋并以幾種不同濃度研究1 μg總RNA轉(zhuǎn)化的cDNA樣品。將稀釋的cDNA與靶向小鼠CCL5、PKA或GAPDHcDNA序列的一對引物(10 μmol/L)混合，如上所述，并與15 μL體積的SYBR green PCR master mix(Applied Biosystems，CA)混合。 PCR循環(huán)如下：在50℃下2 min，在95℃下10 min進行1個循環(huán)，然后在15℃下在95℃下進行40個循環(huán)，在60℃下進行1 min進行定量實時PCR。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠刻板行為評分和曠場實驗評分

誘導(dǎo)組與對照組大鼠相比刻板行為評分和曠場實驗均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明用苯丙胺誘導(dǎo)的大鼠精神分裂模型建模成功。(表2)

2.2 前額葉皮質(zhì)蘇木精-伊紅染色

誘導(dǎo)組較對照組細胞陽性率占比高，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。誘導(dǎo)組前額葉椎體細胞大量核固縮，箭頭指向代表固縮現(xiàn)象。胞漿嗜伊紅染色增強，胞膜與周圍分界清楚，對照組未發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組此現(xiàn)象。(圖1，表3)

2.3 PKA和CCL5 mRNA表達

與對照組相比，誘導(dǎo)組大鼠PKA和CCL5 mRNA表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(圖2，表4)

2.4 PKA和CCL5蛋白含量檢測

誘導(dǎo)組大鼠體內(nèi)PKA和CCL5含量與對照組相比升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(表5)

2.5 白細胞介素(IL-1α、IL-1β和IL-17)的蛋白表達檢測

誘導(dǎo)組與對照組相比IL-1α、IL-1β和IL-17的蛋白表達均增加，促炎反應(yīng)加強，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(圖3，表6)

表2 大鼠刻板行為評分和曠場試驗評分

圖1 前額皮質(zhì)的病理學(xué)改變(蘇木精-伊紅染色)(×200)Figure 1 Pathological changes of the rat prefrontal cortex tissues. Hematoxylin-eosin staining

表3 核固縮細胞陽性率占比

表4 PKA和CCL5基因mRNA表達量

圖2 RT-qPCR檢測PKA和CCL5 mRNA表達Figure 2 RT-q PCR for detection of PKA and CCL5 gene expressions

組別GroupsPKA(mmol/g)CCL5(mmol/g)對照組Control group2.46±0.671.35±0.24誘導(dǎo)組Induced group4.21±1.053.76±0.51t5.2213.268P0.0050.021

圖3 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測白細胞介素相關(guān)蛋白Figure 3 Detection of interleukin-related proteins by Western blotting

組別GroupsIL-1αIL-1βIL-17對照組Control group1.02±0.170.94±0.131.05±0.25誘導(dǎo)組Induced group2.85±0.352.15±0.272.16±0.32t6.7618.6435.238P0.0260.0150.003

3 討論

精神疾病是全球最普遍和最致殘的疾病之一。世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2030年，精神疾病將成為全球疾病負擔(dān)的主要原因。近年來，這些病癥的臨床管理幾乎沒有改善，因為臨床醫(yī)生受到當(dāng)前藥物制劑的次優(yōu)效果和主觀現(xiàn)象學(xué)診斷范例的阻礙，對這些疾病的發(fā)病機制和病理生理學(xué)機制的深入理解有可能為這些疾病的治療提供改進的治療和診斷工具[14]。細胞因子和這種神經(jīng)免疫軸的炎癥方面已經(jīng)得到了最深入的研究，然而調(diào)節(jié)這些方面的轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用迄今還沒有取得很大進展[15-16]。其他研究途徑也開始探索適應(yīng)性免疫細胞及其相關(guān)細胞因子在其中的作用。目前，在這些研究中相對忽略了被稱為趨化因子的免疫蛋白，最近有證據(jù)表明這些蛋白質(zhì)可能在與精神疾病相關(guān)的神經(jīng)免疫過程中起關(guān)鍵作用[17]。包括以前未被認識的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑效應(yīng)，直接神經(jīng)遞質(zhì)樣作用，神經(jīng)內(nèi)分泌軸的調(diào)節(jié)，血腦屏障滲透性的控制，神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)，神經(jīng)保護作用以及軸突傳遞和伸長的調(diào)節(jié)[18]。

本研究通過大鼠刻板行為評分為和曠場實驗發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組與對照組大鼠相比刻板行為評分和曠場實驗均升高，這表明用苯丙胺誘導(dǎo)的大鼠精神分裂模型建模成功。本實驗?zāi)康氖窃u估前額葉皮質(zhì)區(qū)PKA和CCL5在精神分裂癥疾病中表達變化情況。早期證據(jù)表明趨化因子可能在精神分裂樣本中被上調(diào)。該研究發(fā)現(xiàn)血漿CCL5在精神分裂疾病中增加，CCL5 mRNA和蛋白質(zhì)在精神分裂模型前額葉組織的腦微血管系統(tǒng)中以更高水平表達，這可能與作為支持滲透的趨化因子相關(guān)。大多數(shù)已發(fā)表的研究，包括測量這些精神疾病中的趨化因子，都涉及到炎癥性趨化因子CCL5[19]。因此，未來的工作應(yīng)該考慮除炎癥過程中涉及的其他趨化因子的測量。本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組前額葉椎體細胞大量核固縮，箭頭指向代表固縮現(xiàn)象。胞漿嗜伊紅染色增強，胞膜與周圍分界清楚，對照組未發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組此現(xiàn)象。本研究的行為和病理反映損傷反映大鼠精神分裂模型認知功能發(fā)生障礙，其原因與前額葉椎體細胞大量核固縮死亡有關(guān)。

本研究生化研究的結(jié)果顯示，與對照組相比，誘導(dǎo)組大鼠PKA和CCL5 mRNA表達量升高；誘導(dǎo)組大鼠體內(nèi)PKA和CCL5含量與對照組相比升高；誘導(dǎo)組與對照組相比IL-1α、IL-1β和IL-17的蛋白表達均增加，促炎反應(yīng)加強；誘導(dǎo)組較對照組細胞陽性率占比高。這說明，趨化因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多炎癥或感染性疾病中高度表達，包括多發(fā)性硬化，實驗性過敏腦脊髓炎，阿爾茨海默病，精神分裂性疾病病等[20]。盡管在這些病變中檢測到幾種促炎介質(zhì)，但已顯示趨化因子可刺激神經(jīng)細胞產(chǎn)生這些其他介質(zhì)。趨化因子降低神經(jīng)性細胞內(nèi)cAMP水平和PKA活性通過腺苷酸環(huán)化酶從細胞內(nèi)ATP產(chǎn)生環(huán)狀A(yù)MP，腺苷酸環(huán)化酶是一種膜結(jié)合酶，其對G蛋白活化的敏感性不同。本研究中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)精神分裂癥實驗大鼠中的PKA和CCL5含量水平、蛋白表達都比正常組大鼠的高，說明精神分裂癥狀的前額葉神經(jīng)細胞受到里不同程度的損傷。其中檢測到白細胞介素(IL-1α、IL-1β和IL-17)的表達升高進一步表明誘導(dǎo)組的炎癥反應(yīng)加重。

綜上所述，精神分裂癥大鼠模型中前額葉椎體細胞大量核固縮，胞漿嗜伊紅染色增強，前額葉皮質(zhì)PKA和CCL5都有相應(yīng)的高表達，增加炎癥反應(yīng)發(fā)生，在藥物處理上可針對這兩個指標(biāo)進行靶向治療。