UPLC-MS/MS法測(cè)定新疆冷水魚中孔雀石綠與隱色孔雀石綠

李曉巖 ，武 運(yùn)，王犁燁 ，蘇 敏，沈慧慧，巴哈提古麗·馬那提拜

(1.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，烏魯木齊 830063；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】新疆冷水魚肉質(zhì)鮮美、口感獨(dú)特、有較高的營養(yǎng)價(jià)值，是新疆特有魚種之一，有良好的市場(chǎng)前景，在南北疆各地區(qū)已形成一定的養(yǎng)殖規(guī)模[1,2]。由于冷水魚幼魚感染疫病的幾率比較高，常給冷水魚養(yǎng)殖造成極大的損失，為了防止這類情況發(fā)生，養(yǎng)殖者曾用孔雀石綠(MG)來對(duì)各種魚類和水產(chǎn)品進(jìn)行殺菌、消毒、凈化水質(zhì)以及保鮮[3]。MG又稱堿性綠、苯胺綠，屬于合成三苯甲烷類化工染料的一種，具有高效廣譜的殺菌作用[4,5]，在其進(jìn)入人體后會(huì)代謝產(chǎn)生隱色孔雀石綠(LMG)，二者都具有高殘留等毒性[6-10]。國際上將MG以及LMG列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物[11]。2002年我國農(nóng)業(yè)部也將其列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》中[12,13]，是我國主要打擊的濫用食品添加劑和違法添加非食用物質(zhì)之一。但由于孔雀石綠(MG)具有明顯的殺真菌作用，違禁使用孔雀石綠(MG)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，加大對(duì)冷水魚等水產(chǎn)品的安全抽樣檢測(cè)力度，是重要的手段，但由于我國魚肉中MG及其LMG代謝物殘留量的檢測(cè)分析方法存在操作方法繁瑣，耗時(shí)長且成本較高等，建立一種高效、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、耐用、低成本的檢測(cè)方法，是十分必要的?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】我國魚肉中MG及其LMG代謝物殘留量的檢測(cè)分析方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)[14]、高效液相色譜法-質(zhì)譜法(LC-MS)[15]、氣相色譜法-質(zhì)譜法(GC-MS)[16]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[17]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】GB/T19857-2005、GB/T 20361-2006 等均能測(cè)定孔雀石綠(MG)及其代謝物。但HPLC和ELISA無法提供目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)信息，GB/T19857-2005和GB/T 20361-2006中前處理操作過程耗時(shí)較長，而且目標(biāo)化合物具有不穩(wěn)定性需要迅速處理并進(jìn)行上機(jī)測(cè)定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過優(yōu)化樣品預(yù)處理方法和檢測(cè)條件，有效校正預(yù)處理過程中的誤差和損失，簡(jiǎn)化操作步驟，降低成本，并采用內(nèi)標(biāo)法提高回收率，建立一種更為高效、準(zhǔn)確、低成本的檢測(cè)方法,進(jìn)一步完善新技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材 料

ACQUITY UPLC-Quattro premierXETM質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；VORTEX-5漩渦混合器(華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；腕式振蕩器(美國BURRELL公司)；固相萃取裝置(美國Agilent 公司)；氮吹儀(美國Organomation 公司)；高速離心機(jī)(日本HITACHI公司)；Bond Elut-SCX(強(qiáng)陽離子交換)固相萃取柱(500 mg/3 mL)(美國Agilent公司)；DIKMA ProElut C18 (500 mg/6mL)(北京迪馬科技有限公司)；Oasis HLB (500 mg/6mL)(美國Waters公司)；0.2 μm再生纖維素濾膜(美國Waters公司)。

孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氘代孔雀石綠(D5-MG)、氘代隱色孔雀石綠(D6-L MG)標(biāo)準(zhǔn)品(美國Dr公司)；甲醇、乙腈、丙酮(色譜純，F(xiàn)isher 公司)；冰乙酸、無水硫酸鈉(Na2SO4)、氨基(NH2)吸附劑、氨水、乙酸銨、98%甲酸：(優(yōu)級(jí)純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水均為高純水。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

用乙腈溶液將MG、LMG及D5-MG、D6-L MG標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并根據(jù)需要用甲醇-水(2:8，v/v)溶液稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，存儲(chǔ)于棕色瓶中，4℃保存，有效期3個(gè)月。

1.2.2 色譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫35℃，樣品室溫度7℃；流量0.25 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相：A溶液為10 Mmol/L乙酸銨[含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸，B溶液為乙腈；MG和LMG藥物梯度洗脫程序：0～2 min，A由60%～10%；2～5 min 10%保持3 min。5～5.5 min10%～60%；5.5 min～7.5 min 60%～60%。

1.2.3 質(zhì)譜條件

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式質(zhì)譜參數(shù)
Table 1 Multi-reaction monitoring scan mode mass spectrometry parameters

化合物Compound母離子Parention(m/z)子離子Daughterions(m/z)錐孔電壓Conevoltage(U/V)碰撞能量Collisionenergy(E/eV)孔雀石綠(MG)329.1207.7?,312.83535,35隱色孔雀石綠(LMG)331.1239.0?,315.83530,20氘代孔雀石綠(D5-MG)334.1317.93535氘代隱色孔雀石綠(D6-LMG)337.0240.03530

注：*為定量離子

Note:*is a quantitative ion

1.2.4 樣品前處理

將去骨的魚肉樣品，用刀式研磨均質(zhì)儀2 500 r/min粉碎至漿狀

稱取5.00 g試樣，置于50 mL離心管中，加入適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取15 mL 1%冰乙酸-乙腈溶液，振蕩20 min，加入6 g無水硫酸鈉，渦旋1 min，4 500 r/min離心10 min，放置20 min。

1.2.5 初凈化

量取7.5 mL上清液至15 mL離心管中，加入400 mg NH2，渦旋2 min，4 500 r/min離心10 min。

1.2.6 SCX 固相萃取柱凈化

準(zhǔn)確移取1.2.5中上清液6 mL于15 mL試管中，加入0.3 mL甲酸混合，為待凈化液。SCX固相萃取柱凈化：用2.5 mL乙腈-甲酸溶液(98：2)平衡活化。將待凈化液轉(zhuǎn)移至小柱中，用2.5 mL乙腈溶液沖洗試管，轉(zhuǎn)移至小柱中，依次用2.5 mL丙酮溶液、2.5 mL甲醇溶液、2.5 mL乙腈溶液洗滌，將10 mL刻度試管置于固相萃取柱下，用7.5 mL氨水-乙腈(6：94)溶液洗脫，接收洗脫液。在氮?dú)庀?5℃緩緩吹干，用400 μL甲醇-水(2：8，v/v)溶解殘?jiān)瑴u旋振蕩30 s，用0.2 μm再生纖維素濾膜過濾至1 mL全回收樣品瓶中，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇和優(yōu)化

魚肉中富含蛋白質(zhì)、維生素、無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分，脂肪含量相對(duì)較少。乙腈能夠使蛋白質(zhì)變性沉淀，離心后去除；Na2SO4能吸收基質(zhì)中的水分；NH2作為吸附劑能吸附基質(zhì)提取液中部分脂肪和碳水化合物。用純乙腈作為提取液，待測(cè)物的峰形不對(duì)稱，靈敏度低，而在乙腈溶液中加入一定量冰乙酸后，待測(cè)物的峰形較好和靈敏度較高。由于MG和LMG在酸性環(huán)境下能夠以一種穩(wěn)定狀態(tài)存在，分別選擇濃度為0.3%、0.5%、1%的冰乙酸-乙腈溶液進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)表明，1%的冰乙酸-乙腈提取液使目標(biāo)化合物的峰形和靈敏度最好。

2.2 固相萃取柱的選擇

分別對(duì)DIKMA ProElut C18 500 mg/6 mL、Agilent BOND ELUT-SCX 500 mg/3 mL、Oasis HLB 500 mg/6 mL三種固相萃取柱進(jìn)行了選擇。試驗(yàn)表明，SCX 500 mg/3 mL固相萃取柱能夠較好的保留目標(biāo)化合物，并能夠使樣品中的雜質(zhì)與目標(biāo)化合物完全分離，能夠準(zhǔn)確定量，滿足回收率的要求。

2.3 色譜條件的選擇和優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了Acquity BEH C18 (2.1 mm×50 mm.1.7 μm)、ODS C18 Hypersil 5 μm，250 mm × 4 mm色譜柱的分離情況，前者對(duì)MG和LMG能完全分離,保留時(shí)間具有較好的穩(wěn)定性，對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)適用性更好，同時(shí)色譜圖基線分離，色譜峰型對(duì)稱，雜峰干擾少。MG、LMG的保留時(shí)間分別為1.58 min、3.02 min。圖1

2.3.1 流動(dòng)相的選擇

目標(biāo)化合物的測(cè)定是采用正離子模式，用極性色譜柱C18來分離，通常使用乙腈溶液和甲醇溶液作為有機(jī)相，乙酸銨或甲酸銨、乙酸或甲酸溶液作為水相。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用10 mmol/L乙酸銨[含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸]溶液和乙腈溶液作為流動(dòng)相時(shí)，待測(cè)物的靈敏度和峰形都比較好。選擇流動(dòng)相10 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)溶液為A，乙腈溶液為B。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別用0.5 mg/LMG、LMG的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，通過ESI()模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，能夠得到每種目標(biāo)化合物的母離子，再對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，以MRM模式進(jìn)行檢測(cè)分析。通過調(diào)節(jié)錐孔電壓和碰撞能量，使其特征離子響應(yīng)值達(dá)到最高，最終確定每種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)。表1

2.5 定性及定量

對(duì)樣品目標(biāo)化合物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如果樣品中化合物質(zhì)量色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間一致(變化范圍為±2.5%之內(nèi))；檢測(cè)到樣品質(zhì)譜圖中所選擇的離子均出現(xiàn)，同時(shí)所選擇的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的離子豐度比一致，最大允許相對(duì)偏差不得超過文獻(xiàn)[19]中規(guī)定的范圍，可以確定樣品中存在目標(biāo)化合物，采用內(nèi)標(biāo)法定量。

2.6 線性關(guān)系及檢出限

分別移取適量的MG、LMG及內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成目標(biāo)含量為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中內(nèi)標(biāo)物含量為20 μg/L，上機(jī)測(cè)定。以目標(biāo)化合物峰面積對(duì)內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)Y，以目標(biāo)化合物相應(yīng)的添加含量(μg/kg)的峰面積對(duì)內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為橫坐標(biāo)X，兩者呈線性關(guān)系。

圖1 MG及D5-MG和LMG及D6-MG標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖
Fig. 1 MG and D5-MG,LMG and D6-MG standard solution spectra

檢出限(LOD)為特征離子色譜峰的信噪比(S/N)大于3，定量限(LOQ)為(S/N)大于10，得到MG、LMG的LOD為0.6 μg/kg，LOQ為2.0 μg/kg。表2

表2 孔雀石綠及隱色孔雀石綠線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)
Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient of malachite green and leuco malachite green

化合物Compound線性范圍Linearrange(μg/L)線性方程Linearequation相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient(r2)孔雀石綠(MG)5.0～100.0Y=2.76231X+0.2410270.9997隱色孔雀石綠(LMG)5.0～100.0Y=0.75473X+0.9260830.9992

2.7 回收率與精密度

以魚肉為樣品(實(shí)測(cè)值為未檢出)，做3個(gè)水平的添加回收試驗(yàn)分別為2.0 、5.0 和10.0 μg/kg，每組試驗(yàn)重復(fù)6次 (n=6)。

MG和LMG的平均回收率分別為88%～105%和85%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均為2.2%～15.3%。該方法回收率和精密度符合國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)要求，該方法準(zhǔn)確具有可行性。表3

表3 孔雀石綠、隱色孔雀石綠回收率及精密度(n=6)
Table 3 Malachite green, leuco malachite green recovery and precision (n=6)

化合物Compound2.0μg/kg5.0μg/kg10.0μg/kg回收率Recoveryrate(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)回收率Recoveryrate(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)回收率Recoveryrate(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)孔雀石綠(MG)882.2922.81052.3隱色孔雀石綠(LMG)853.79711.711015.3

3 討 論

根據(jù)魚肉樣品基質(zhì)的特點(diǎn)以及MG和LMG的相關(guān)物理化學(xué)性質(zhì)，采用1%冰乙酸-乙腈溶液提取，氨基及SCX(強(qiáng)陽離子交換)固相小柱凈化，C18 色譜柱分離，電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式(MRM)進(jìn)行檢測(cè)，并采用內(nèi)標(biāo)法定量。實(shí)驗(yàn)MG和LMG在魚肉中低、中、高 3水平添加下的回收率分別為88%～105%和85%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為2.2%～15.3%。MG和LMG在魚肉中的定量限為 2.0 μg/kg。為快速檢測(cè)新疆冷水魚中MG及LMG含量提供方法支持。

4 結(jié) 論

該檢測(cè)方法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，前處理步驟少，試劑用量大為減少，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，具有更高效、更準(zhǔn)確且回收率高、低成本的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)MG和LMG在魚肉中低、中、高 3水平添加下的回收率分別為88%～105%和85%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為2.2%～15.3%。MG和LMG在魚肉中的定量限為 2.0 μg/kg。在檢測(cè)冷水魚等水產(chǎn)品中孔雀石綠(MG)和隱色孔雀石綠(LMG)的實(shí)際應(yīng)用中，效果良好。