殘次棗粉添加青貯苜蓿中微生物、發(fā)酵和營養(yǎng)品質(zhì)動態(tài)規(guī)律

張 玲，席琳喬，張凡凡，王旭哲，馬春暉

(1. 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 83200；2. 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】紫花苜蓿(MedicagosativaL.)營養(yǎng)豐富，消化率高，苜蓿青貯飼喂奶牛，產(chǎn)奶量高，是優(yōu)質(zhì)牧草[1]。但因苜蓿較高的蛋白含量與緩沖度、較低的可溶性碳水化合物，單獨青貯不易成功；同時原料上附著的乳酸菌數(shù)量少，不良微生物在發(fā)酵過程中占據(jù)主導(dǎo)作用，導(dǎo)致青貯飼料干物質(zhì)損失和蛋白水解[2-4]。【前人研究進展】駿棗(ZiziphusRhamnaceae)作為南疆地區(qū)紅棗產(chǎn)品中的龍頭產(chǎn)業(yè)，近年來因天氣、加工技術(shù)和供求等因素影響，每年產(chǎn)生年總產(chǎn)量10%～15%的殘次棗果[5]，這些殘次棗果不僅容易儲藏利用，而且含有較高的糖、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，其中總糖含量約為50.3%～80.9%[6]。然而其表面附著多種致腐微生物[7]，不利于單獨青貯。因此將其干燥后作為添加劑與高水分苜蓿青貯，不僅可抑制不良微生物繁殖，增加青貯早期有益菌乳酸菌數(shù)量，快速形成理想的酸性環(huán)境，降低pH，改善青貯發(fā)酵品質(zhì)；而且可控制青貯飼料的水分含量，減少能量損失?！颈狙芯壳腥朦c】目前有關(guān)紫花苜蓿青貯方面的研究主要集中于有氧穩(wěn)定期青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響[3,8,9]，但是棗粉添加至高水分紫花苜蓿中進行青貯研究較少[10]，尤其是針對其青貯發(fā)酵過程中微生物數(shù)量、發(fā)酵和營養(yǎng)品質(zhì)的變化規(guī)律未見報道。研究不同添加量的殘次棗粉對紫花苜蓿青貯發(fā)酵過程中微生物數(shù)量、發(fā)酵和營養(yǎng)品質(zhì)動態(tài)變化的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究設(shè)置不同添加量的殘次棗粉與紫花苜蓿青貯，在青貯發(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段的不同時間點對青貯飼料微生物數(shù)量、發(fā)酵特征和營養(yǎng)品質(zhì)的動態(tài)變化規(guī)律進行分析，篩選出適宜的棗粉添加量，為研究青貯發(fā)酵機理和廣泛應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

紫花苜蓿為第三茬盛花期三得利(Medicagosativa‘sanditi’)，種植于新疆阿克蘇地區(qū)溫宿縣沙河鎮(zhèn)第一師五團試驗田(N41°17′38.1′′～41°21′35.9′′，E80°40′07.1′′～80°47′38.2′′)，其含水量為72%左右，粉碎(1～2 cm)備用。殘次駿棗選自新疆阿拉爾市豐之源紅棗加工廠，剔除發(fā)霉和變質(zhì)的駿棗，帶核干燥(65℃)至含水量10%以下，粉碎備用。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

依據(jù)青貯發(fā)酵所需的最低可溶性碳水化合物(占青貯鮮重的1～1.5%)標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計6個不同殘次棗粉添加量處理，分別按照對照處理(T0處理)，即不添加棗粉、0.5%(T1處理)、2.5%(T2處理)、5%(T3處理)、7.5%(T4處理)、10%(T5處理)的添加量添加至粉碎的紫花苜蓿中。添加后混勻，用噴壺噴灑去離子水(72%)以保證發(fā)酵體系含水量的一致性。取不同處理的青貯原料置于冰盒中，帶回實驗室，-20℃貯藏，用于微生物菌落、發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)成分的測定。同時將不同處理的青貯樣品裝入33 cm×48 cm的聚乙烯青貯袋中，每袋1.5 kg，每個處理3次重復(fù)，用真空包裝機(DZQ500-1D)抽真空密封，室溫下貯藏60 d，分別于發(fā)酵的第1 d、3 d、7 d、15 d、30 d、60 d(模擬開窖)取不同處理樣品，棄去上層，取中間樣品，監(jiān)測乳酸菌、酵母菌、霉菌、好氧細菌數(shù)量變化以及用于發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)成分分析。

1.2.2 測定指標(biāo)

利用稀釋平板涂布法對微生物菌落進行計數(shù)。每個處理各取5 g樣品加入45 mL滅菌水的三角瓶中，置于搖床振蕩30 min，用滅菌水將所得溶液稀釋，制成10-1～10-7系列稀釋梯度。乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)在MRS培養(yǎng)基上，37℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h；酵母菌(Yeast)和霉菌(Mold)分別在麥芽糖浸粉瓊脂培養(yǎng)基和高鹽察氏培養(yǎng)基上28℃條件下培養(yǎng)24～36 h；好氧細菌(Aerobic bacteria, AB)在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30℃有氧條件下培養(yǎng)24～48 h。采用菌落計數(shù)器計數(shù)。

發(fā)酵指標(biāo)和營養(yǎng)品質(zhì)主要測定pH、乳酸(Lactic acid, LA)、乙酸(Acetic acid, AA)、銨態(tài)氮(NH3-N)、總氮(TN)、干物質(zhì)(Dry matter, DM)、粗蛋白(Crude protein, CP)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber, ADF)、可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate, WSC)。其中pH采用PHSJ-5智能酸度計測定，LA和AA采用HPLC測定，NH3-N采用苯酚-次氯酸比色法測定[8-9]，TN和CP采用頂級碳氮元素分析儀測定(Vario MICRO cube，德國Elementar公司)，DM采用重量法測定，NDF和ADF采用范氏(Van Soest)洗滌纖維法，WSC采用蒽酮-硫酸比色法測定[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2010軟件對所有數(shù)據(jù)進行初步整理，采用SPSS 20.0軟件進行方差分析，并采用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 殘次棗粉對苜蓿青貯發(fā)酵過程中微生物數(shù)量、發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)成分的動態(tài)變化

添加殘次棗粉對苜蓿青貯前后各處理微生物種類和數(shù)量動態(tài)變化為，青貯前乳酸菌數(shù)量為5.05～5.80 log cfu(g·FM)，酵母菌數(shù)量為6.88～7.27 log cfu(g·FM)，霉菌數(shù)量為3.40～4.06 log cfu(g·FM)，好氧細菌數(shù)量為8.01～9.24 log cfu(g·FM)?？梢姼街⑸飻?shù)量最多的是好氧細菌，其次是酵母菌，之后是乳酸菌，霉菌數(shù)量最少。T4處理的乳酸菌數(shù)量顯著高于其余處理(P<0.05)，T0處理的酵母菌和霉菌數(shù)量最高(P<0.05)。表1

發(fā)酵初期，各處理乳酸菌數(shù)量逐漸增加，至第7 d各處理均達到最大值，T0處理顯著低于其它處理(P<0.05)，T4處理顯著高于其它處理(P<0.05)。之后，各處理乳酸菌數(shù)量緩慢下降，發(fā)酵結(jié)束時，自高到低排序為T4處理>T3處理>T5處理>T2處理>T1處理>T0處理(P=0.013)；各處理的酵母菌數(shù)量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)下降趨勢，且T0處理高于其它處理(P<0.05)。發(fā)酵第60 d時，T4處理最低，僅為3.35 log cfu/(g·FM)(P<0.01)；各處理霉菌數(shù)量在發(fā)酵進程中逐步下降，自發(fā)酵第7 d開始，T4處理未檢測到霉菌數(shù)量。發(fā)酵至30 d開始，T1～T5處理霉菌數(shù)量均消失；發(fā)酵初期，T0、T1、T2和T5處理的好氧細菌含量緩慢上升至最大值，T4處理有所下降(P<0.05)。隨后各處理的好氧細菌數(shù)量隨發(fā)酵時間的推移，逐漸下降，發(fā)酵結(jié)束時，自高到底排序為T0和T1處理>T2、T5、T3和T4處理(P=0.041)。

棗粉與苜蓿青貯發(fā)酵過程中不同處理的發(fā)酵指標(biāo)變化，發(fā)酵的第1～3 d，各處理pH值下降緩慢，第1 d，各處理pH值無差異性變化(P=0.306)，發(fā)酵至第3 d，T0處理顯著高于其它處理(P=0.016)。隨著發(fā)酵時間的延長，各處理pH值下降迅速，其中T4處理的pH值下降最為明顯，顯著低于其它處理(P<0.05)。直至發(fā)酵第60 d，按高低排序為T0處理>T1處理>T2處理>T5處理>T3處理>T4處理(P<0.01)；發(fā)酵初期(1～3 d)各處理LA和AA含量有所波動，T4處理和T5處理緩慢增加，發(fā)酵進行至第7 d時，各處理LA和AA含量逐漸增加，H4處理顯著高于其它處理(P<0.05)，而T0處理顯著低于其它處理(P<0.05)。同時T1～T5處理隨著棗粉添加量的增加，LA和AA含量顯著增加。發(fā)酵結(jié)束時，各處理LA和AA含量均達到最大值，LA按高低排序為T4處理>T5處理>T3處理>T2處理>T1處理>T0處理(P<0.01)，AA按高低排序為T4處理>T3處理>T5處理>T2處理>T0處理>T1處理(P<0.01)；發(fā)酵前期(0～15 d)，各處理的LA/AA值波動明顯(表1)，T1處理顯著高于其它處理(P<0.05)，之后各處理LA/AA值緩慢增加，發(fā)酵結(jié)束時，各處理LA/AA比值按大小排序為，T1處理>T0、T4和T5處理>T2和T3處理(P=0.016)。

隨著發(fā)酵時間的延長，各處理NH3-N變化明顯，發(fā)酵第1 d，自高到低排序為T4處理>T2處理>T1處理>T0處理>T3處理>T5處理(P=0.005)，至發(fā)酵第3 d，各處理NH3-N含量均有所下降(P=0.036)。隨著發(fā)酵時間推移，各處理NH3-N含量均逐漸上升，至青貯發(fā)酵結(jié)束時，各處理NH3-N含量均達到最大值，自高到低排序為T0處理>T1處理>T2處理>T3處理>T5處理>T4處理(P<0.01)；發(fā)酵初期(1～3 d)，各處理NH3-N/TN值有所波動，之后各處理的NH3-N/TN值逐步增加，并且T0處理顯著高于其它處理(P<0.05)。青貯發(fā)酵第30 d后，NH3-N/TN值隨著殘次棗粉添加量的增加而降低，其中，T3和T4處理顯著低于其它處理(P<0.05)，至發(fā)酵結(jié)束時，T0處理的NH3-N/TN值最大(P<0.01)。

不同添加量的殘次棗粉與苜蓿青貯發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分動態(tài)變化明顯，各處理DM含量在發(fā)酵初期(1～7 d)，有所波動(P<0.05)，至發(fā)酵第7 d時，按高低排序為T4和T3處理>T5處理>T1處理、T2處理和T0處理(P=0.013)。之后隨著發(fā)酵時間延長，各處理DM含量均逐漸下降，至發(fā)酵60 d，各處理均達到最低值，自高到低排序為T3處理和T4處理>T5處理>T2處理、T1處理和T0處理(P=0.019)；各處理CP含量在青貯發(fā)酵初期(1～7 d)有所波動，隨著發(fā)酵時間的增加，各處理的CP含量逐漸下降，T1～T5處理低于T0處理(P<0.05)，并且隨著棗粉添加量的增加而降低。直至青貯發(fā)酵結(jié)束，各處理CP含量自高到低為T0處理>T1處理>T5處理和T2處理>T3處理和T4處理(P<0.01)；發(fā)酵第1 d，各處理的NDF和ADF含量分別為39.50%～49.60%和23.98%～33.65%，隨著發(fā)酵時間延長，各處理的NDF和ADF含量均有所下降，發(fā)酵至15 d以后，T0處理均高于其它處理(P<0.01)，發(fā)酵結(jié)束時，各處理的NDF和ADF含量有顯著差異(P<0.05)，NDF按優(yōu)劣排序為T4處理>T2處理>T5處理>T3處理>T1處理>T0處理(P<0.01)，ADF按優(yōu)劣排序為T4處理>T2處理>T3處理>T1處理>T5處理>T0(P<0.01)；青貯發(fā)酵的第1～3 d，各處理的WSC含量有所波動，達到最大值，差異顯著(P<0.01)。之后隨著發(fā)酵時間的延長，各處理的WSC含量均表出現(xiàn)下降趨勢。至發(fā)酵結(jié)束時，各處理的WSC含量均達到最低值，按高低排序為T5>T4>T3>T2>T1>T0(P=0.016)；整個發(fā)酵過程中，T1～T5處理的WSC含量顯著高于T0處理(P<0.05)，并且隨著殘次棗粉添加量的增加，其WSC含量呈增加趨勢。

發(fā)酵時間和處理分別對乳酸菌、酵母菌和好氧菌數(shù)量以及pH、LA、AA、NH3-N、NH3-N/TN、DM、CP、NDF、ADF、WSC含量影響極顯著(P<0.01)；發(fā)酵時間對LA/AA產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)，處理對LA/AA變化產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)；發(fā)酵時間和處理的雙因素交互作用對乳酸菌、酵母菌和好氧菌數(shù)量以及pH、LA、AA、NH3-N、NH3-N/TN、DM、NDF、ADF、WSC含量產(chǎn)生極顯著的影響(P<0.01)，對LA/AA和CP含量變化無顯著影響(P>0.05)。表1

3 討 論

3.1 添加殘次棗粉對苜蓿青貯微生物的影響

微生物種類和數(shù)量直接影響著青貯飼料的品質(zhì)[11]。研究中隨著發(fā)酵進行，各處理的乳酸菌數(shù)量增加，至第7 d達到最大值，是由于發(fā)酵初期，植物呼吸和好氧微生物活動，青貯袋內(nèi)氧氣被逐漸耗盡，好氧微生物停止活動，形成厭氧狀態(tài)，乳酸菌逐漸占據(jù)絕對優(yōu)勢。而T1～T5處理的乳酸菌數(shù)量明顯多于T0處理，是由于棗粉WSC含量豐富，為乳酸菌的迅速繁殖提供更多的營養(yǎng)需求。之后，各處理乳酸菌數(shù)量緩慢下降，一是因為乳酸菌發(fā)酵，乳酸含量不斷積累，pH降低至一定范圍，反而對乳酸菌造成酸性脅迫，致使乳酸菌數(shù)量和活性下降；二是隨著發(fā)酵時間延長，WSC含量逐漸被消耗，乳酸菌活動強度減弱。

酵母菌在無氧和有氧環(huán)境中均可繁殖，是引起青貯飼料好氧變質(zhì)的原因之一，研究中各處理酵母菌數(shù)量逐漸下降，并且隨著殘次棗粉添加量的增加有所下降，原因是隨著發(fā)酵時間推移，青貯袋內(nèi)氧氣逐漸減少，厭氧菌種通過糖發(fā)酵來獲取能量。但各處理酵母菌仍未消失，可能是因為酵母菌耐酸強，在厭氧和耐酸條件下利用底物產(chǎn)生能量無法抑制其生長[12]。霉菌是引起青貯飼料腐敗變質(zhì)的有害微生物，部分霉菌會產(chǎn)生霉菌毒素，降低青貯飼料品質(zhì)，危害家畜健康[13]。通過研究發(fā)現(xiàn)，各處理霉菌數(shù)量隨著發(fā)酵時間延長逐漸下降直至消失，然而T0處理在整個青貯過程中都存在，表明添加殘次棗粉為酸性環(huán)境和厭氧條件的形成提供充足的底物保障，有效地抑制了霉菌滋生。而好氧菌發(fā)酵初期的波動是因為發(fā)酵初期利用植物細胞機械壓榨后排出含有可溶性碳水化合物的養(yǎng)分，使其有所增加，但隨著乳酸菌不斷積累，厭氧環(huán)境的形成，好氧細菌受到抑制。

3.2 添加殘次棗粉對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

青貯發(fā)酵的實質(zhì)是在厭氧環(huán)境下，乳酸菌分解糖類，產(chǎn)生乳酸，促使青貯飼料pH顯著下降，抑制微生物活動，從而使青貯飼料長期保存。低pH值可防止二次發(fā)酵，減少DM損失，提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性[14]。大量研究證實苜蓿半干青貯可提高青貯的成功率，然而基于高水分苜蓿青貯的調(diào)制，目前還未得到有效解決。研究中添加了富含發(fā)酵底物的駿棗粉進行青貯，隨著發(fā)酵時間和棗粉添加量的增加而LA含量增加，pH降低，表明棗粉與苜蓿青貯后可促進乳酸菌發(fā)酵，產(chǎn)生較多的LA，從而使青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)得到改善，該結(jié)果與Adesogan等[15]研究結(jié)果相似。但當(dāng)添加量至10%時，LA含量降低，pH值升高，是由于駿棗粉過多添加提高乳酸菌的競爭性或是刺激同異型發(fā)酵乳酸菌活性，導(dǎo)致產(chǎn)酸性能受限。AA是異型發(fā)酵的產(chǎn)物，其生成主要包括2個途徑，于青貯發(fā)酵后期可有效抑制酵母菌和霉菌生長，提高有氧穩(wěn)定性，防止飼料腐敗變質(zhì)[16]。研究中，隨著發(fā)酵的進行，pH逐漸降低，AA含量逐漸增多，這說明發(fā)酵類型由同型向異型轉(zhuǎn)變，與未添加棗粉處理組相比，添加處理組增加了AA含量，可能是因為異型乳酸菌比同型乳酸菌在酸性和低pH條件下更具有耐受性。NH3-N是青貯發(fā)酵過程中飼料蛋白質(zhì)和氨基酸被降解的結(jié)果[17]。NH3-N/TN越高，說明被降解的蛋白氮越多，品質(zhì)越差，進而影響動物的采食量和飼料利用率[18]。苜蓿因蛋白質(zhì)含量高，蛋白降解嚴(yán)重，NH3-N對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)影響較大。本研究中，苜蓿單獨青貯時NH3-N含量較添加棗粉處理組高，同時，NH3-N/TN表現(xiàn)出相同的規(guī)律，進一步表明增加棗粉極大的降低了青貯飼料腐敗變質(zhì)的可能性，改善了苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)，與Schmidt[19]等研究結(jié)果相一致。

3.3 添加殘次棗粉對苜蓿青貯營養(yǎng)成分的影響

牧草種類、干物質(zhì)含量、可溶性糖等因素直接影響著青貯品質(zhì)[20]。制作青貯飼料的牧草須含有適宜的可溶性碳水化合物作為發(fā)酵底物(≥10%DM)[13]，而紫花苜蓿的WSC含量低，決定了其單獨青貯很難成功。在研究中，隨著棗粉添加量的增加，青貯發(fā)酵體系中WSC含量逐漸增加，這為乳酸菌的發(fā)酵提供了豐富的底物，從而快速形成理想的酸性環(huán)境，有效地抑制有害微生物活動，減少不良發(fā)酵產(chǎn)物形成，這與西蘭花莖葉稻秸苜蓿混合青貯中添加蜜糖研究結(jié)論相似[21]。隨著發(fā)酵時間延長，DM含量逐漸下降，由于青貯初期水分含量相對較高，作為營養(yǎng)底物的WSC含量也相對較高，被微生物逐漸利用后，DM含量損傷逐漸增加。隨著棗粉添加量的增加，DM含量有所增加，是因為棗粉作為營養(yǎng)添加劑，在增加青貯飼料中WCS含量的同時，也可降低水分含量，從而減少微生物對青貯飼料營養(yǎng)成分的消耗。CP是評價粗飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)。通過研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時間推移，各處理的CP含量逐漸下降，是因為青貯發(fā)酵過程中的不良微生物分解氨基酸、嘌呤、嘧啶和氮鹽類，產(chǎn)生氨態(tài)氮，導(dǎo)致大量的CP降解，這與許慶方等[22]研究苜蓿青貯與青貯前相比，真蛋白含量下降，約占總氮的60～80%的試驗結(jié)果相似。但是由于棗粉CP含量較低，隨著棗粉添加量的增加，青貯飼料的CP含量呈現(xiàn)下降趨勢。在青貯制作的實際操作過程中，為了使青貯料的蛋白質(zhì)和能量得到平衡，要對棗粉的添加量加以適當(dāng)控制。NDF和ADF含量是反映纖維質(zhì)量最有效的指標(biāo)，含量越低，營養(yǎng)品質(zhì)越好，其中ADF與動物消化率呈負相關(guān)，是指示飼草能量的關(guān)鍵。研究中，NDF和ADF含量隨著發(fā)酵時間推移逐漸下降，是因為青貯初期含有部分纖維素酶的微生物[23]，逐漸消耗青貯飼料中營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生纖維素酶，導(dǎo)致ADF和NDF逐漸下降。同時將棗粉添加至苜蓿中進行青貯與苜蓿單獨青貯相比，其NDF和ADF含量顯著降低，原因是棗粉所含的WSC含量高，產(chǎn)生的有機酸在青貯期間可水解更易消化的細胞壁部分[24]。

4 結(jié) 論

4.1 青貯發(fā)酵過程中，殘次棗粉添加量為5%時，顯著提高苜蓿青貯飼料的DM含量；當(dāng)添加量增加到7.5%時，進一步顯著增加青貯發(fā)酵體系中LA和AA含量，降低NH3-N、NDF和ADF含量；當(dāng)添加量達到10%時，雖然對于DM、NDF和ADF含量以及產(chǎn)酸能力有所變差，但顯著提高發(fā)酵體系中CP和WSC含量。殘次棗粉添加量為5%～10%時顯著降低發(fā)酵體系中蛋白腐敗的程度。

4.2 整個青貯發(fā)酵過程中，殘次棗粉添加量為7.5%時，均顯著增加乳酸菌數(shù)量，抑制酵母菌、霉菌和好氧菌數(shù)量。