膜性腎病患者臨床病理特點(diǎn)及外周血T及Th細(xì)胞亞群分析

(保定市第二中心醫(yī)院1.血液腎病科，2.血透室，河北 保定072750)

膜性腎病是原發(fā)性腎小球腎炎中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。流行病學(xué)研究顯示，約30%的膜性腎病患者5年內(nèi)病情自行緩解，70%的患者表現(xiàn)為持續(xù)性蛋白尿，半數(shù)以上的患者8～12年發(fā)展為終末期腎病[2]。免疫抑制劑是目前治療膜性腎病的主要方案，但由于膜性腎病患者病情轉(zhuǎn)歸的不同，導(dǎo)致免疫抑制劑的應(yīng)用存在較大爭(zhēng)議[3]。準(zhǔn)確評(píng)估膜性腎病患者臨床病理特點(diǎn)及免疫功能狀況，篩選出可能進(jìn)入終末期腎病的患者，對(duì)治療方案的選擇具有重要意義。本研究根據(jù)24 h蛋白尿、血清白蛋白水平將膜性腎病患者分為中高危組、低危組，分析病理分期、腎小球球性硬化、IgG等病理特點(diǎn)；并以健康志愿者為對(duì)照，分析T及Th細(xì)胞亞群水平，旨在為膜性腎病治療方案的選擇及免疫失衡機(jī)制的闡明提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年6月至2018年10月間本院收治的膜性腎病患者100例。入選標(biāo)準(zhǔn)[4]：①年齡≥18歲，經(jīng)腎組織活檢確診為膜性腎病；②無(wú)環(huán)磷酰胺、糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢素等免疫抑制劑或細(xì)胞毒性藥物服用史。排除標(biāo)準(zhǔn)[5]：①合并自身免疫性疾病、過(guò)敏性哮喘；②合并感染性疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病；③血肌酐>309 μmol/L，或合并威脅生命的腎病綜合征并發(fā)癥。根據(jù)24 h蛋白尿、血清白蛋白水平分為中高危組(24 h蛋白尿≥4 g，血清白蛋白≤20 g/L)78例，低危組(24 h蛋白尿<4 g，血清白蛋白>20 g/L)22例。高危組中男性54例，女性24例；年齡26～65歲，平均年齡(48.59±12.64)歲。低危組中男性17例，女性5例；年齡24～68歲，平均年齡(49.02±11.90)歲。選取同期體檢的健康志愿者66名為對(duì)照組，其中男性56例，女性10例；年齡25～62歲，平均年齡(48.85±12.03)歲。三組受試者性別、年齡之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 腎組織病理指標(biāo)檢測(cè) ①光學(xué)顯微鏡觀察：取腎活檢組織，10%甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，分別行HE染色、過(guò)碘酸六胺銀染色、過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)、Masson染色；光學(xué)顯微鏡下觀察病理分期、腎小球球性硬化、腎小球節(jié)段硬化、新月體、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管急性病變區(qū)[6]。②免疫熒光檢測(cè)：取腎組織進(jìn)行冰凍直接切片，5%胎牛血清封閉20 min，磷酸緩沖液洗滌，滴加鼠抗人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單克隆抗體，均為1∶500稀釋，37 ℃孵育2 h，滴加山羊抗鼠IgG，1∶1 000稀釋，37 ℃孵育40 min，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 外周血單核細(xì)胞分離 收集受試者空腹肘靜脈血4 mL，抗凝處理后與5 mL DMEM培養(yǎng)基混合均勻，加入淋巴細(xì)胞分離液，3 000 r/min離心30 min，吸取上層與中層交界處的外周血單核細(xì)胞，加入10 mL DMEM培養(yǎng)基，2 000 r /min離心10 min，除去淋巴細(xì)胞分離液；用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，分裝入流式細(xì)胞管中保存待用，每管中細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)。

1.2.3 外周血單核細(xì)胞中Th細(xì)胞亞群檢測(cè) 取10 μL外周血單核細(xì)胞懸液，滴加10 μL 0.2%臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞活性并計(jì)數(shù)；余下的外周血單核細(xì)胞懸液以2 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，使用DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL于流式細(xì)胞管中。設(shè)置同型對(duì)照管、試驗(yàn)管，每管中加入5 μL anti-CD4 (FITC)，室溫下避光靜置30 min，磷酸緩沖液洗滌后，2 000 r/min離心10 min，去除上清，滴加600 μL固定和透化溶液(Fixation/Permeabilization Solution)，避光反應(yīng)30 min；加入5 mL配制好的BD Perm/Wash洗滌、2 000 r/min離心后去除上清，向試驗(yàn)管中滴加5 μL的anti-IFN-γ-FITC、anti-IL-9-PE、anti-IL-4-APC，同型對(duì)照管中滴加anti-IgG1-PE、anti-IgG1-APC各2 μL，避光反應(yīng)40 min，多聚甲醛固定后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 外周血中T細(xì)胞檢測(cè) 設(shè)置同型對(duì)照管、試驗(yàn)管，分別取400 μL抗凝處理后的肘靜脈血，均加入Anti-CD4 (PerCP)、Anti-CD25 (APC)各10 μL，室溫下避光反應(yīng)30 min；每個(gè)流式細(xì)胞管中分別加入溶血素3 mL，避光靜置20 min，加入1 mL磷酸緩沖液洗滌，2 000 r/min離心10 min，去除上清，加入1 mL Fixation/Permeabilization Solution固定、通透，避光靜置90 min，加入2 mL的Permeabilization Buffer，2 000 r/min離心10 min，去除上清，滴加Anti-FOXP3-PE 10 μL，同型對(duì)照管滴加Anti-IgG-PE 10 μL，室溫下避光反應(yīng)30 min，多聚甲醛固定后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差、百分比表示，進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，使用SPSS21.0處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者病理檢查指標(biāo)比較

間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管急性病變區(qū)在中高危組與低危組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中高危組間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管急性病變區(qū)范圍明顯大于低危組。病理分期、腎小球球性硬化、腎小球節(jié)段硬化、新月體在兩組患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。電鏡下可見(jiàn)兩組患者腎小球基底膜均增厚，上皮下及系膜區(qū)有電子致密物沉積。見(jiàn)圖1。

2.2 各組患者IgG不同亞型沉積情況分析

膜性腎病患者中IgG4熒光強(qiáng)度最高，IgG2熒光強(qiáng)度最弱，見(jiàn)圖2。同一患者IgG不同亞型中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)定義為IgG亞型主沉淀。中高危組患者中IgG4為主沉淀的比例最高，且明顯高于低危組(P<0.01)；低危組患者中IgG1主沉淀的比例最高，且明顯高于中高危組(P<0.01)；低危組患者中IgG2、IgG3主沉淀的比例明顯高于中高危組(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表1 中高危組與低危組患者病理檢查指標(biāo)比較 (例,%)

圖1 電鏡下觀察腎小球基底膜增厚(15000×)

表2 各組患者IgG亞型主沉積情況比較 (例,%)

圖2 兩組患者免疫熒光IgG不同亞型沉積情況

2.3 各組患者外周血T及Th細(xì)胞亞群情況分析

T細(xì)胞亞群中CD3+CD45+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中高危組和低危組CD3+CD45+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。Th細(xì)胞亞群中Th9、Th1、Th2、Th2/Th9在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Th9、Th1、Th2水平明顯高于對(duì)照組，Th2/Th9明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組患者外周血T及Th細(xì)胞亞群情況分析

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與低危組比較，bP<0.05

3 討 論

膜性腎病是最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球腎炎之一，發(fā)病率僅次于IgA腎病[7]。膜性腎病患者的臨床自然轉(zhuǎn)歸存在較大差異，準(zhǔn)確評(píng)估患者病理特點(diǎn)及免疫情況，預(yù)測(cè)可能發(fā)展為終末期腎病的高?；颊撸瑢?duì)臨床治療方案的制定具有重要意義。本文根據(jù)24 h蛋白尿及血清白蛋白水平將膜性腎病患者分為中高危組、低危組，比較臨床病理特點(diǎn)。結(jié)果顯示，膜性腎病患者病理分期以Ⅱ期為主，但中高危組與低危組之間無(wú)明顯差異。相關(guān)研究顯示，高齡、高血壓、腎功能減退的膜性腎病患者病理分期較高[8]。目前膜性腎病分期與癥狀及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)間的關(guān)系仍存在較大爭(zhēng)議，需進(jìn)一步大樣本量深入研究。中高危組間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、小管急性病變區(qū)的范圍均明顯高于低危組，提示尿蛋白量越大，膜性腎病患者腎臟急性和慢性病變程度越嚴(yán)重；根據(jù)蛋白尿分級(jí)可用于膜性腎病預(yù)后評(píng)估。IgG包括4種亞型，其中IgG4與膜性腎病的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系最明顯,研究者發(fā)現(xiàn)，IgG4是抗磷脂酶A2受體抗體與1型血小板反應(yīng)蛋白7A域的特異性抗體，是鑒別特發(fā)性膜性腎病與繼發(fā)性膜性腎病的主要標(biāo)志物。膜狼瘡性腎炎存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4高表達(dá)[9]。本研究以特發(fā)性膜性腎病患者為研究對(duì)象，IgG亞型中以IgG4熒光強(qiáng)度最高，IgG2熒光強(qiáng)度最弱。中高危組以IgG4為主要亞型沉積，低危組以IgG1為主要亞型沉積。研究者發(fā)現(xiàn)，膜性腎病不同發(fā)病期的主要IgG亞型沉積存在差異，發(fā)病早期以IgG1為主要沉積[10]，而IgG4通過(guò)經(jīng)典途徑對(duì)補(bǔ)體的激活能力弱，早期水平偏低，發(fā)病晚期在腎小球皮下沉積[11]。

正常狀態(tài)下T細(xì)胞亞群可維持一定數(shù)量和比例，機(jī)體免疫功能處于正常狀態(tài)；當(dāng)T細(xì)胞亞群之間平衡失調(diào)會(huì)引發(fā)細(xì)胞因子分泌異常，導(dǎo)致免疫失調(diào)[12-13]。本研究顯示，中高危組患者CD3+CD4+、CD4+/CD8+水平明顯高于對(duì)照組，且CD3+CD8+呈下降趨勢(shì)，與相關(guān)研究報(bào)道一致[14]；提示膜性腎病患者外周血T細(xì)胞亞群以CD4+T細(xì)胞水平升高為主，CD4+/CD8+比值增加。但上述改變也存在于IgA腎病[15]，因此CD4+/CD8+變化不能作為膜性腎病的特異性表現(xiàn)。研究者對(duì)IgA腎病患者外周血Th1、Th2研究顯示，Th2水平明顯提升，且與24h蛋白尿呈正相關(guān)，但Th1未出現(xiàn)明顯改變，存在Th1/Th2平衡失調(diào)[16]。之后研究者從膜性腎病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離純化得到B細(xì)胞，與IL-4、IL-10等細(xì)胞因子在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IgG亞型發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞與Th2分泌的IL-4共培養(yǎng)后，IgG4較其他研究組明顯提升[17]。亦有研究者對(duì)ANCA相關(guān)性腎炎、膜性腎病患者的腎組織行RT-PCR檢測(cè)顯示，IL-4 mRNA主要沉積于膜性腎病，且與IgG4呈正相關(guān)[18]。上述研究分別從體外分離細(xì)胞和腎組織層面上證實(shí)了膜性腎病主要以Th2細(xì)胞反應(yīng)為主，進(jìn)而促進(jìn)IgG4分泌。本研究中膜性腎病患者外周血Th1、Th2細(xì)胞因子均明顯低于正常對(duì)照組，且Th1/Th2呈下降趨勢(shì)，低危組趨勢(shì)最明顯；與相關(guān)研究報(bào)道一致[19]；提示膜性腎病患者存在Th1/Th2平衡失調(diào)。以往對(duì)腎病患者的研究多集中于CD4+/CD8+、Th1/Th2，對(duì)Th9的研究較少[20-21]。Th9具有多種生物學(xué)活性，與Th細(xì)胞亞群相關(guān)，其中與Th2關(guān)系最明顯[22]。本研究顯示，膜性腎病患者外周血Th9明顯高于對(duì)照組，且中高危組明顯高于低危組，膜性腎病患者Th2/Th9明顯低于對(duì)照組。提示膜性腎病患者存在Th9細(xì)胞反應(yīng)，且Th2向Th9偏移，Th9過(guò)表達(dá)與膜性腎病發(fā)展有關(guān)。