紫莖澤蘭處理雞球蟲卵囊的免疫效果評(píng)價(jià)

晏云濤 呂瑞青 項(xiàng)勛 李朝 楊建發(fā) 段綱

摘要：為了評(píng)價(jià)紫莖澤蘭對雞柔嫩艾美爾球蟲卵囊活性的抑制效果，采用不同濃度紫莖澤蘭提取液處理新鮮的雞球蟲卵囊，計(jì)算各組的孢子化率，并將處理后的孢子化卵囊接種幼雞，再進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，通過測克卵囊數(shù)（指1 g糞便中含有的卵囊數(shù)）、抗球蟲指數(shù)等指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)紫莖澤蘭對雞球蟲卵囊活性的影響。結(jié)果顯示，紫莖澤蘭處理組的球蟲孢子化率受到不同程度的抑制，與對照組存在顯著差異（P<0.05），對處理組幼雞進(jìn)行免疫攻毒，其存活率（100%）、抗球蟲指數(shù)（186.6）、增質(zhì)量率（99.6%）和病變記分（+0.7）均優(yōu)于陽性對照組，且免疫組與陽性對照組抗球蟲指數(shù)之間差異極顯著（P<0.01），表明紫莖澤蘭可致弱雞球蟲卵囊活性，為紫莖澤蘭研制成病原致弱劑或殺蟲劑奠定了基礎(chǔ)，也為球蟲致弱和球蟲基因缺失苗的研究提供了新思路。

關(guān)鍵詞：雞球蟲;紫莖澤蘭;孢子化率;抗球蟲指數(shù)

中圖分類號(hào)： S858.31 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）16-0171-03

收稿日期：2018-05-09

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)（編號(hào)：2017YFD0501405、2017YFD0501303）。

作者簡介：晏云濤（1994—），女，云南昆明人，碩士研究生，主要從事畜禽寄生蟲病研究，

通信作者：段 綱，碩士，教授，主要從事畜禽藥理毒理學(xué)研究。

紫莖澤蘭（Euptorium adenophorum Spreng）是一種外來入侵植物，具有極強(qiáng)的適應(yīng)性和侵占能力，會(huì)破壞生態(tài)的多樣性[1]。紫莖澤蘭危害性極強(qiáng)，可以引起人皮膚紅腫，甚至出現(xiàn)接觸性皮炎，牲畜容易誤食紫莖澤蘭，從而引起腹瀉、脫毛、流產(chǎn)甚至死亡[2]，牛、馬等動(dòng)物吸入紫莖澤蘭帶有纖毛的種子和花粉后容易引起哮喘，用紫莖澤蘭墊羊圈，可引起羊蹄腐爛[3]。在國家生態(tài)環(huán)境部公布的首批入侵國內(nèi)的16種外來物種黑名單中，紫莖澤蘭名列第一，被稱為“生物癌癥”[4]。因此，許多科研工作者將目光投向紫莖澤蘭的生態(tài)利用，周世敏等研究表明，以紫莖澤蘭為原料制成的生物碳的燃燒值（4.42×107 J/kg）明顯大于以德國橡木為原材料生產(chǎn)的生物碳的燃燒值（3.4×107 J/kg）[5];田果廷等用紫莖澤蘭作栽培原料可栽培出田頭菇、平菇、金針菇、柳松茸、香菇和雞腿菇等多種食用菌，其產(chǎn)量高、成本低、營養(yǎng)豐富、食用安全[6];王鳳等以紫莖澤蘭草粉為載體制成的芳香防蛀緩釋片劑外形完好且香味持久，可達(dá)3個(gè)月以上[7]。

雞感染球蟲?。╟occidiosis）主要通過攝入有活力的孢子化卵囊，凡被帶蟲雞的糞便污染了的飼料、飲水、用具和土壤等，都可能傳播球蟲[8-9]，導(dǎo)致家畜飼養(yǎng)環(huán)境的污染。目前，雞球蟲病的防治多采用化學(xué)藥物，其產(chǎn)生的耐藥性、肉蛋產(chǎn)品藥物殘留、環(huán)境污染等問題也日趨嚴(yán)重[10]。

本試驗(yàn)選用紫莖澤蘭作用于雞球蟲卵囊，通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)，觀測處理后的卵囊對雞的免疫保護(hù)效果，為將紫莖澤蘭開發(fā)為獸醫(yī)臨床實(shí)踐的植物抑制劑、消毒劑，替代其他化學(xué)消毒藥品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 球蟲蟲株

本試驗(yàn)所用雞球蟲卵囊為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存的雞柔嫩艾美耳球蟲，于2017年11月通過感染小雞獲得新鮮卵囊。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

7日齡白羽肉雞，2017年11月購自云南省昆明市某市場，在嚴(yán)格消毒的無球蟲環(huán)境下飼養(yǎng)，器具使用前嚴(yán)格消毒，所用飼料為自行配制，不含驅(qū)蟲藥物。試驗(yàn)前鏡檢糞便，確定無球蟲感染。

1.1.3 主要試劑

紫莖澤蘭初提液;0.5%重鉻酸鉀;3% NaOH;飽和食鹽水;95%乙醇。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫莖澤蘭初提液的制備

稱取500 g紫莖澤蘭粉末，加10倍量的95%乙醇，于50 ℃加熱浸提4 h;依次使用60目、200目網(wǎng)篩將浸提液過濾到滅菌廣口瓶中，用布氏漏斗過濾，濾渣用95%乙醇再次浸提4 h，過濾，如此重復(fù)過濾3次，再將每次過濾后的濾液混合;濾液經(jīng)60 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾至黑褐色膏狀物且質(zhì)量不再變化為止;將得到的膏狀濃縮物用電子天平準(zhǔn)確稱質(zhì)量，然后用滅菌水將膏狀濃縮物配成 1 g/mL 的母液，配好的母液密封、避光，于4 ℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.2.2 新鮮雞球蟲卵囊的準(zhǔn)備

用筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的雞柔嫩艾美爾球蟲卵囊接種15日齡雞，接種量為 7 000個(gè)/羽，嚴(yán)格消毒，分籠飼養(yǎng)，感染后7 d進(jìn)行糞檢，連續(xù)收集 7～9 d 的糞便，收集未孢子化的卵囊。

1.2.3 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

在培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入10 mL 0.5%重鉻酸鉀溶液和104個(gè)分離的球蟲卵囊，1～5號(hào)加入一定量的紫莖澤蘭液，調(diào)整其終濃度為0.1%、0.5%、1.0%、2.5%和5.0%，每個(gè)濃度組做3個(gè)平行試驗(yàn);6號(hào)加入0.5 mL蒸餾水作為陰性對照;7號(hào)加入0.5 mL 3% NaOH作為陽性對照。將各培養(yǎng)皿放入29 ℃溫箱中進(jìn)行孢子化培養(yǎng)，每天用膠頭吸管間斷性吹氣3次，36 h后顯微鏡下計(jì)數(shù)具有感染性卵囊的孢子化率[12]。

1.2.4 紫莖澤蘭處理后的孢子化卵囊感染動(dòng)物試驗(yàn)

將上述試驗(yàn)中5個(gè)不同濃度處理后試驗(yàn)組、陰性和陽性對照組的孢子化卵囊分別接種15日齡幼雞，接種劑量按照2 000個(gè)/羽，每組接種20羽幼雞，同時(shí)設(shè)接種0.5 mL蒸餾水作為空白對照，接種前稱取每組雞的體質(zhì)量。攻毒后6 d進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，10 d后記錄雞死亡和增質(zhì)量情況，剖殺所有雞，進(jìn)行病變記分、計(jì)算抗球蟲指數(shù)（ACI）。

1.2.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

用紫莖澤蘭液處理的最佳濃度組孢子化卵囊接種（首次免疫）20羽15日齡的小雞，免疫接種劑量為2 000個(gè)/羽，接種后15 d，試驗(yàn)組小雞再用強(qiáng)毒球蟲攻毒，攻毒劑量為105個(gè)孢子化球蟲卵囊/羽，攻毒后6 d進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，10 d后記錄雞死亡和增質(zhì)量情況，剖殺全部雞進(jìn)行病變記分、計(jì)算ACI;同時(shí)設(shè)立陽性對照組（不免疫攻毒組）、陰性對照組（不免疫不攻毒空白組）。通過上述指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)紫莖澤蘭液致弱球蟲的免疫保護(hù)力。

1.2.6 評(píng)價(jià)指標(biāo)

克卵囊數(shù)（OPG）、病變記分、血糞值和ACI的計(jì)算參照文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫莖澤蘭對雞球蟲孢子化的影響

球蟲卵囊孵化3 d后，收集各組球蟲卵囊，并計(jì)算各組孢子化率，每組計(jì)算3次，求平均值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，各紫莖澤蘭處理組的球蟲孢子化受到了不同程度的抑制（表1），且通過SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析顯示，試驗(yàn)組與對照組間孢子化存在顯著差異（P=0.029<0.05）。

2.2 紫莖澤蘭處理后孢子化卵囊感染動(dòng)物的結(jié)果

攻毒后6 d，收集各組雞糞便，用改良麥克馬斯特計(jì)數(shù)板計(jì)算糞便中的OPG，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各試驗(yàn)組單位質(zhì)量糞便卵囊數(shù)均小于陽性對照組，且隨著紫莖澤蘭液濃度的增加，單位質(zhì)量卵囊數(shù)有逐漸減小的趨勢。攻毒后10 d，統(tǒng)計(jì)各組雞的存活率、相對增質(zhì)量率，剖殺雞，進(jìn)行病變記分，統(tǒng)計(jì)血糞值、ACI，見表2。結(jié)果顯示，與對照組相比，各試驗(yàn)組和陰性對照組的雞未有死亡;陰性對照組雞腸道無病變發(fā)生，各試驗(yàn)組雞腸道病變程度較陽性對照組輕，詳見圖1至圖7。說明紫莖澤蘭液對雞具有一定的免疫保護(hù)性。各試驗(yàn)組的相對增質(zhì)量率和抗球蟲指數(shù)均高于陽性對照組，各相對增質(zhì)量率和抗球蟲指數(shù)隨著紫莖澤蘭液終濃度的增加也呈提高的趨勢，且50%和2.5%濃度組表現(xiàn)出了中等抗球蟲效果。SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析顯示，試驗(yàn)組與陽性對照組間抗球蟲指數(shù)存在顯著差異（P=0.018<0.05）。

2.3 紫莖澤蘭處理后孢子化卵囊的免疫保護(hù)結(jié)果

在免疫攻毒后6 d，收集紫莖澤蘭5%濃度試驗(yàn)組與對照組雞糞便，用改良麥克馬斯特計(jì)數(shù)板計(jì)算OPG，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組的克卵囊數(shù)顯著少于陽性對照組，陰性對照無球蟲卵囊檢出，詳見表3。免疫攻毒后10 d，統(tǒng)計(jì)各組雞存活率、相對增質(zhì)量率，剖殺雞，進(jìn)行病變記分，統(tǒng)計(jì)血糞值，計(jì)算ACI，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組雞未有死亡，腸道病變較輕微，只有少量出血，見圖8至圖10。相對增質(zhì)量率和抗球蟲指數(shù)都顯著高于陽性對照組，且抗球蟲指數(shù)>180，屬于高效抗球蟲，經(jīng)SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析顯示，免疫組與陽性對照組抗球蟲指數(shù)之間差異極顯著（P=0<0.01）。由此可見，經(jīng)紫莖澤蘭處理的球蟲卵囊對雞有良好的免疫保護(hù)性。

3 討論

已有報(bào)道表明，紫莖澤蘭具有抑制動(dòng)物寄生蟲蟲體或蟲卵活性的效果。在26 ℃條件下，紫莖澤蘭花葉提取液作用于馬圓線蟲蟲卵，隔天取樣5 g用漂浮法記錄蟲卵孵化情況，表明高濃度浸泡液中蟲卵的檢出率較低，孵出的幼蟲不能正常發(fā)育[14];不同分子質(zhì)量的紫莖澤蘭液作用于未孢子化的孔雀球蟲卵囊會(huì)抑制其卵囊活性[15];椎實(shí)螺放入紫莖澤蘭不同濃度不同部位的浸泡液中，根莖花葉都具有殺滅螺的效果，僅作用時(shí)間長短不同[16];紫莖澤蘭95%乙醇提取物對兔癢螨和疥螨具有較強(qiáng)的離體殺滅活性;紫莖澤蘭石油醚萃取物對牛足螨也有較強(qiáng)的離體殺滅活性[17];紫莖澤蘭經(jīng)甲醇石油醚丙酮萃取后對黏蟲觸殺效果較好的部位是花和葉[18]。

云南省多樣的氣候環(huán)境，導(dǎo)致云南省很多養(yǎng)雞場時(shí)有球蟲病發(fā)生，據(jù)報(bào)道，云南省多數(shù)養(yǎng)雞場球蟲病的防治成本占全部防治疾病成本的30%[19]。在臨床上，抗球蟲藥分為聚醚類離子載體抗生素和化學(xué)合成藥，?其對球蟲的防控和治療發(fā)揮了重要的作用，但由于藥物濫用，導(dǎo)致耐藥蟲株產(chǎn)生、藥物殘留、污染環(huán)境等問題;部分雞場聯(lián)合使用多價(jià)球蟲疫苗，而疫苗使用不當(dāng)導(dǎo)致雞發(fā)病的情況時(shí)有發(fā)生，多價(jià)疫苗的使用也有可能給當(dāng)?shù)貛硪郧皼]有的球蟲新種。為此，開發(fā)新型植物抗球蟲藥就顯得尤為迫切。袁銘雅用紫莖澤蘭治療雞球蟲病，能干擾蟲卵的正常孵化過程，抑制卵囊的生長繁殖[20];譚文彪等用紫莖澤蘭花的第三級(jí)提取物治療雞球蟲病，其抗球蟲指數(shù)為180.20，療效達(dá)到高效[21];和曉銀用紫莖澤蘭的異丙醇提取物2級(jí)分離物對雞球蟲病的治療效果ACI為174，屬于中效偏上[22]。

結(jié)果表明，各試驗(yàn)組ACI隨紫莖澤蘭液濃度的增加而增大，各試驗(yàn)組OPG隨紫莖澤蘭液濃度的增加有逐漸減小的趨勢，提示紫莖澤蘭提取物能有效抑制雞球蟲卵囊的活性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)用紫莖澤蘭提取液處理后的球蟲孢子化率顯著低于對照組，紫莖澤蘭作用的試驗(yàn)組抗球蟲指數(shù)顯著高于陽性對照組，且抗球蟲指數(shù)>180，屬于高效抗球蟲，說明紫莖澤蘭抑制了雞球蟲孢子化階段的活性。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉選富，張亞奇. 紫莖澤蘭（Eupatorium adenophora）對云南松林生物多樣性的影響[J]. 四川林勘設(shè)計(jì)，2016（2）：39-44.

[2]劉伯言. 入侵植物紫莖澤蘭的資源化利用研究[D]. 北京：中國科學(xué)院大學(xué)，中國科學(xué)院過程工程研究所，2017.

[3]李霞霞，張欽弟，朱珣之. 近十年入侵植物紫莖澤蘭研究進(jìn)展[J]. 草業(yè)科學(xué)，2017，34（2）：283-292.

[4]李永明，李正躍，葉 敏. 紫莖澤蘭不同部位的化學(xué)成分及其生物活性[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，23（1）：42-46，72.

[5]Zhou S M，Ou G T. Technology in utilization of Eupatorium adenophorum biomass energy[J]. Agricultural Engineering & Agricultural Machinery，2014，15（6）：1037-1038，1057.

[6]田果廷，徐學(xué)忠，楊瓊芬，等. 利用紫莖澤蘭栽培田頭菇的研究[J]. 中國食用菌，2004（4）：13-15.

[7]王 鳳，趙 靜，劉 強(qiáng)，等. 紫莖澤蘭基芳香防蛀緩釋劑的制備與性能研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（18）：175-179.

[8]Wattrang E，Thebo P，Lunden A，et al. Monitoring of local CD8β-expressing cell populations during Eimeria tenella infection of naive and immune chickens[J]. Parasite Immunology，2016，38（8）：453-467.

[9]夏維福，郭冬生，李龍輝，等. 不同抗球蟲藥物對雞球蟲病療效對比試驗(yàn)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（3）：256-258.

[10]陳希文，房春林，郭曉萍，等. 雞柔嫩艾美耳球蟲綿陽地方株的分離鑒定及致病性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（6）：315-317.

[11]張妙直，田兆豐，劉佳磊，等. 紫莖澤蘭提取物對幾種植物病原真菌的抑制作用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（12）：6090-6091，6105.

[12]周作勇，王芝英，胡世君，等. 6種殺蟲劑對雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊孢子化率及致病力的影響[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2015，51（3）：91-94.

[13]索 勛. 雞球蟲學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998：257.

[14]趙 平，王榮瓊，楊曉乾，等. 恒溫條件下紫莖澤蘭花、葉提取液對馬圓線蟲蟲卵的孵化試驗(yàn)[J]. 山東畜牧獸醫(yī)，2010，31（11）：2-3.

[15]王榮瓊，袁飛洲，呂瑞青，等. 紫莖澤蘭液對孔雀球蟲活性的影響[J/OL]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，28（6）：917-919.

[16]李 兵，趙 平，陳 娟，等. 紫莖澤蘭浸泡液對椎實(shí)螺殺滅效果觀察[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（9）：4069-4070.

[17]農(nóng) 向. 紫莖澤蘭提取物對動(dòng)物寄生螨類的殺滅效果及殺蟲活性成分研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[18]王云梅，付立會(huì)，黃修芬，等. 紫莖澤蘭提取物對粘蟲觸殺作用研究初探[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016，32（2）：61-67.

[19]王 昊，路義鑫. 禽類球蟲病的防治[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息，2013（4）：96-97.

[20]袁銘雅. 用紫莖澤蘭治療雞球蟲病的研究[J]. 當(dāng)代畜牧，2015（23）：64-65.

[21]譚文彪，朱玉蘋，王李松，等. 利用紫莖澤蘭花第三級(jí)提取物治療雞球蟲病試驗(yàn)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：227-229.

[22]和曉銀. 用紫莖澤蘭葉異丙醇提取物二級(jí)組分治療雞球蟲病的實(shí)驗(yàn)[J]. 畜禽業(yè)，2016（7）：14-15.