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    鉀營(yíng)養(yǎng)調(diào)控?zé)煵轃焿A生物合成關(guān)鍵基因研究

    2019-11-02 13:16:49李軍營(yíng)晉艷王俊蘇國(guó)興
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年16期
    關(guān)鍵詞:煙株煙堿煙葉

    李軍營(yíng) 晉艷 王俊 蘇國(guó)興

    摘要:為明確鉀營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)對(duì)煙堿生物合成的影響規(guī)律,采用定量PCR和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,研究不同供鉀量條件下,煙草葉片煙堿含量和根系腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)與喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(QPT)的表達(dá)情況。結(jié)果表明,低鉀供應(yīng)會(huì)增加煙葉的煙堿含量、促進(jìn)根系PMT基因的表達(dá);高鉀供應(yīng)對(duì)煙葉的煙堿合成和根系的PMT基因表達(dá)具有明顯的抑制效應(yīng)。低鉀處理后再恢復(fù)正常鉀供應(yīng)水平,可顯著降低由低鉀供應(yīng)對(duì)煙堿合成和PMT基因表達(dá)的促進(jìn)作用。不同的供鉀水平同樣影響QPT基因的表達(dá)水平,但與煙堿積累量的變化不存在明顯的相關(guān)性。因此,煙草植株的煙堿含量受供鉀水平的影響,鉀可能通過控制根系腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)來影響煙葉中煙堿的積累。

    關(guān)鍵詞:煙草;鉀營(yíng)養(yǎng);腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶;喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶;煙堿;生物合成;關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)量

    中圖分類號(hào):S572.06 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2019)16-0106-03

    收稿日期:2018-05-07

    基金項(xiàng)目:中國(guó)煙草總公司云南省公司資助項(xiàng)目(編號(hào):2017YN06、2016YN05、2016YN28)。

    作者簡(jiǎn)介:李軍營(yíng)(1978—),男,河北滄州人,博士,副研究員,主要從事煙草栽培研究。Tel:(0871)65106249;

    通信作者:晉 艷,碩士,研究員,主要從事煙草栽培研究。Tel:(0871)65100188;

    煙葉中的鉀離子參與煙葉的生理生化反應(yīng),與煙株的抗逆性關(guān)系密切,對(duì)于煙草農(nóng)業(yè)來說,它還影響著煙葉的內(nèi)在品質(zhì)和工業(yè)可用性,通常把鉀含量作為衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)[1]。鉀對(duì)煙葉成熟度、香吃味、燃燒性、安全性等方面均有重要影響,鉀含量越高,往往煙葉的質(zhì)量越優(yōu)[2]。在鉀對(duì)煙堿積累的影響方面,不同學(xué)者的觀點(diǎn)不一致。左天覺認(rèn)為,鉀對(duì)煙堿的積累幾乎沒有影響[3];胡國(guó)松等報(bào)道,高鉀施用量增加了上部葉中的煙堿含量[4];舒海燕等研究了施鉀對(duì)煙草農(nóng)藝性狀和煙堿含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),施鉀可提高煙葉中鉀含量,促進(jìn)植株生長(zhǎng),降低煙葉中煙堿含量[5]。然而關(guān)于鉀對(duì)煙堿合成的影響機(jī)制尚不清楚。Richards等研究表明,鉀營(yíng)養(yǎng)與植物腐胺的積累有關(guān),缺鉀可促進(jìn)多種植物腐胺的積累[6-7]。由于腐胺是煙堿生物合成的前體物質(zhì),鉀有可能通過腐胺影響煙葉煙堿的積累。為驗(yàn)證這個(gè)假設(shè),本研究采用砂培法,以不同濃度的鉀溶液處理煙草,并采用定量PCR技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,分析不同供鉀量對(duì)煙草煙堿含量和煙堿代謝關(guān)鍵酶腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)、喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(QPT)基因相對(duì)表達(dá)量的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料處理

    試驗(yàn)用煙草(Nicotiana tabacum L.)品種為K326,由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。試驗(yàn)于2015年在蘇州大學(xué)的陽光房?jī)?nèi)進(jìn)行,采用砂基培養(yǎng)法培育煙苗,蛭石和石英砂體積比為1 ∶1。煙草培育采用漂浮育苗法,培育至4葉期后,選取生長(zhǎng)整齊的幼苗移入砂培塑料盆中。培育期間,晝溫平均為26.5 ℃,夜溫平均為18.3 ℃。在幼苗生長(zhǎng)至8葉1心時(shí),對(duì)煙株進(jìn)行如下處理:(1)對(duì)照(CK)的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(K+含量為0.23 mol/L);(2)T1處理的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中鉀元素(K)稀釋10倍;(3)T2處理的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中K稀釋50倍;(4)T3處理的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中的K擴(kuò)大5倍;(5)T4處理為恢復(fù)組,即T2處理10 d后,再在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中恢復(fù) 10 d。由于Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中的K由KNO3提供,T1、T2處理因稀釋導(dǎo)致的氮素?fù)p失用NaNO3補(bǔ)足,調(diào)節(jié)pH值至5.8±0.1,每隔2 d換1次營(yíng)養(yǎng)液。每盆栽植2株煙草,各處理均設(shè)6組重復(fù)。隨機(jī)選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻一致,沒有發(fā)生病蟲害的煙株,CK、T1、T2、T3分別在處理前及處理后10、20 d采集整株煙苗,T4在處理后直接取樣,其中葉片用于煙堿含量測(cè)定,根系用于PMT基因和QPT基因的表達(dá)分析。

    1.2 營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定

    將新鮮煙株用蒸餾水洗凈,并用吸水紙吸干表面水分,分別稱地上與地下部分質(zhì)量,低溫(-70 ℃)保存。

    1.3 PMT和QPT定量PCR分析

    取煙草根組織,在液氮中迅速研磨,采用Trizol-氯仿-異丙醇法[8]提取總RNA,并采用分光光度計(jì)與瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的總RNA進(jìn)行檢測(cè)。用DNase I在37 ℃下處理RNA提取樣品20 min,以消除DNA干擾。將處理后的總RNA在65 ℃下變性5 min,向總體積為15 mL的總RNA反應(yīng)混合液中加入1 mL隨機(jī)引物(50 mmol/L)、4 mL 10 mmol/L dNTP,反應(yīng)體系中二者濃度分別為2.5、2.0 mmol/L,迅速冰浴冷卻。以提取獲得的總RNA,合成cDNA的第1條鏈。向反應(yīng)體系中加入4 mL 5×UltraScript RTase Buffer和1 mL UltraScript RTase Mix(含200 U/mL RTase,20 U/mL RNasin)后,在 30 ℃ 下預(yù)熱10 min,52 ℃下孵育60 min,隨后在70 ℃下滅活15 min,以降解逆轉(zhuǎn)錄酶。

    用Primer Express software設(shè)計(jì)PCR引物,以煙草α-微管蛋白基因(GenBank登錄號(hào)為J421411.1)為內(nèi)參,該內(nèi)參基因的引物為α-tublin-F:5′-GGAACCTTACAACAGTGTCCT-3′,α-tublin-R:5′-CAAACCTCAACGAGCAGCAAC-3′;PMT基因(GenBank登錄號(hào)為D28506.1)的定量PCR引物為tPMT-F:5′-ACAGAGAATGGTGGATTTCC-3′,tPMT-R:5′-CGATTGAAGGATAACGAAGC-3′;QPT基因(GenBank登錄號(hào)為AB038494.1)的定量PCR引物為tQPT-F:5′-CAGCAATAGCCACCAAGAATAC-3′,tQPT-R:5′-TGTCGCCTTACAAGTCACATC-3′。

    上述所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所用熒光染料為Thermo SBYR GREEN qPCR Master Mix(ROX included)。用兩步法PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增:50 ℃ 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)預(yù)處理2 min,95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火及延伸60 s,40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法[9]進(jìn)行分析。

    1.4 煙堿含量的測(cè)定

    取煙草中部新鮮葉樣,105 ℃殺青后,70~80 ℃烘干,過60目篩,取0.3 g(精確至0.000 1 g)試樣,根據(jù)YC/T 383—2010[10],使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,測(cè)定煙堿含量,所用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀型號(hào)為7890B/5977A GCMS(美國(guó)Agilent公司),煙堿標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自SIGMA公司。

    1.5 統(tǒng)計(jì)分析

    所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 21.0軟件經(jīng)one-way ANOVA分析后,進(jìn)行Duncans多重比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同供鉀水平對(duì)煙株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

    從圖1可以看出,含不同濃度鉀離子的營(yíng)養(yǎng)液對(duì)煙草營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響存在顯著差異。與對(duì)照相比,煙草地上部分與地下部分鮮質(zhì)量均隨鉀供應(yīng)水平的降低而減少。與對(duì)照相比,低鉀水平T1處理和T2處理煙草的地上部分、地下部分鮮質(zhì)量分別減少30.40%、37.64%和42.93%、57.03%,且對(duì)照與T1、T2處理間的差異達(dá)到顯著水平。高鉀水平T3處理煙草地上部分與地下部分的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)也顯著低于對(duì)照。

    由圖2可知,隨著鉀離子濃度的恢復(fù),地上部分和根系的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)可部分恢復(fù)。

    2.2 不同供鉀水平對(duì)煙草葉片煙堿積累的影響

    由圖3可知,在對(duì)照生長(zhǎng)條件下,煙草葉片的煙堿含量隨著植株的生長(zhǎng)顯著增加,與0 d相比,生長(zhǎng)10、20 d后,煙堿含量分別增加24.17%、61.91%。

    不同供鉀水平對(duì)煙草葉片煙堿積累的影響如圖4所示,隨著鉀離子濃度的降低,煙堿的積累量顯著增加,處理后 10 d,T1、T2處理分別比對(duì)照顯著增加3.60%、10.50%;而高鉀水平T3處理對(duì)煙堿的積累則具有顯著的抑制作用。對(duì)T2處理10 d后煙草進(jìn)行鉀恢復(fù)試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著鉀離子濃度的恢復(fù),煙草葉片的煙堿含量隨之減少,較恢復(fù)前降低 13.30%。不同供鉀水平下煙草的煙堿積累量與溶液中的鉀離子濃度呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系,即低鉀水平會(huì)促使煙株大量積累煙堿,而高鉀處理會(huì)抑制煙株體內(nèi)煙堿的合成。

    2.3 不同供鉀水平對(duì)PMT、QPT基因表達(dá)的影響

    2.3.1 不同供鉀水平對(duì)PMT基因表達(dá)的影響

    由圖5可知,在生長(zhǎng)前期,煙草植株有較高的PMT基因表達(dá)水平,且隨著煙株的生長(zhǎng),表達(dá)量逐漸增強(qiáng),不同測(cè)定時(shí)間之間的差異達(dá)顯著水平。

    由圖6可知,處理后10 d,不同鉀離子供應(yīng)水平的營(yíng)養(yǎng)液對(duì)煙草PMT基因的表達(dá)影響顯著,隨著鉀離子濃度的降低,PMT基因表達(dá)水平顯著升高,T1、T2處理分別比對(duì)照增加12.89%、18.93%,;相反,T3處理的PMT基因表達(dá)被顯著抑制。對(duì)T2處理10 d后煙草進(jìn)行鉀恢復(fù)處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著鉀離子濃度的恢復(fù),煙草根系中的PMT基因表達(dá)量顯著下降,較恢復(fù)前下降37.37%。不同供鉀水平下煙草根系中的PMT基因表達(dá)水平與脅迫溶液中的鉀離子濃度呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系,即低鉀水平會(huì)促進(jìn)煙草根系PMT基因表達(dá)量的增加,而高鉀處理會(huì)抑制PMT基因在煙草根系中的表達(dá)。

    2.3.2 不同供鉀水平對(duì)QPT基因表達(dá)的影響

    由圖7可知,在生長(zhǎng)前期,煙草根系中的QPT基因表達(dá)量較高,隨著煙株的生長(zhǎng),QPT表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢(shì),表現(xiàn)出明顯的表達(dá)時(shí)間特異性。圖8為不同供鉀水平對(duì)煙草根系喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響。與PMT基因不同,QPT基因的表達(dá)水平較低,且隨著供鉀水平的降低呈先升高后下降趨勢(shì),而5倍高鉀處理與低鉀處理相比對(duì)QPT基因表達(dá)量有一定程度的上調(diào)作用,但差異不顯著。連續(xù)低鉀(T2處理)脅迫20 d,根系中QPT基因的表達(dá)量達(dá)到最低值;對(duì)T2處理10 d后煙草進(jìn)行鉀恢復(fù)處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),QPT基因表達(dá)量能基本恢復(fù)。

    3 討論

    煙堿在煙草根中合成后,經(jīng)木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)饺~片,貯存在液泡中[11-13]。由于煙葉煙堿含量約占其生物堿總量的90%,煙堿含量的高低影響著煙草的品質(zhì)[14]。本研究結(jié)果表明,鉀離子供應(yīng)水平與煙葉煙堿的積累量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提高鉀離子濃度能有效降低煙草煙堿的積累量。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),鉀離子供應(yīng)水平與煙草根系中的PMT基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,即低鉀會(huì)促進(jìn)PMT基因的表達(dá),使煙草大量積累煙堿,而較高的鉀離子濃度,則會(huì)使PMT基因表達(dá)量下降,?進(jìn)而降低煙堿

    的積累量。研究后期QPT基因表達(dá)水平較低,說明鉀可能不通過調(diào)控QPT基因的表達(dá)來調(diào)控?zé)焿A類物質(zhì)積累。鉀供應(yīng)水平與煙堿積累和PMT基因表達(dá)的這種調(diào)節(jié)關(guān)系,被低鉀處理后的恢復(fù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證,隨著供鉀水平的恢復(fù),PMT基因表達(dá)量下降,煙堿積累量隨之減少。鉀營(yíng)養(yǎng)與植物的腐胺代謝有關(guān)[6-7],而腐胺是煙堿生物合成關(guān)鍵酶PMT的作用底物,其可在底物水平上影響酶的活性,進(jìn)而影響煙堿的積累。本研究結(jié)果表明,鉀可能通過影響PMT基因的表達(dá)來影響煙堿的積累。至于鉀調(diào)節(jié)PMT基因表達(dá)的機(jī)制尚需深入研究。

    有關(guān)鉀營(yíng)養(yǎng)對(duì)煙堿積累的影響已有大量的報(bào)道,基本結(jié)論是土壤的供鉀水平與煙株生長(zhǎng)和煙葉煙堿含量關(guān)系密切,但對(duì)于供鉀水平與煙堿含量確切關(guān)系的結(jié)論尚不統(tǒng)一[3-5]。

    本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,隨著營(yíng)養(yǎng)液中鉀離子濃度的降低,煙株地上與地下部分的鮮質(zhì)量隨之降低,煙堿含量略有升高;鉀離子濃度為對(duì)照組的5倍時(shí),營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)亦呈現(xiàn)下降趨勢(shì),煙堿含量略有下降,這可能是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)液中鉀離子濃度過大時(shí),會(huì)影響植株對(duì)其他離子的吸收,進(jìn)而影響煙株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和煙堿的合成[15]。可見,低鉀水平可促進(jìn)煙葉中煙堿的合成,而高鉀水平的作用則相反。

    本研究發(fā)現(xiàn),鉀離子可能通過影響PMT基因的表達(dá)來影響煙草中煙堿的積累,前人鮮有報(bào)道。在生產(chǎn)實(shí)踐中,本研究可為低鉀土壤通過增施鉀肥來調(diào)控?zé)焿A含量和提高煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

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