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    新型免疫分子TRIM39及其缺失體參與抗禽白血病病毒作用

    2019-11-02 13:16:49劉妮妮張靚伍冰倩周澤建趙珩
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年16期

    劉妮妮 張靚 伍冰倩 周澤建 趙珩

    摘要:禽白血病病毒(avian leukemia virus,簡(jiǎn)稱ALV)引發(fā)的禽白血病致死率高達(dá)10%~20%,嚴(yán)重阻礙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。通過構(gòu)建TRIM39(tripartite motif 39)重組原核表達(dá)載體,分析其在抗禽白血病病毒中的作用,利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)雞白血病病毒抗原,獲得細(xì)胞內(nèi)外病毒濃度變化,發(fā)現(xiàn)TRIM39、TRIM39ΔRING(RING結(jié)構(gòu)域缺失體)、TRIM39ΔB30.2(B-box結(jié)構(gòu)域缺失體)對(duì)禽白血病病毒均有一定的抑制作用,并且缺失體的抑制效果明顯更弱。研究結(jié)果提示,TRIM39參與抗禽白血病病毒的作用,且RING結(jié)構(gòu)域和B-box結(jié)構(gòu)域起著重要的作用。

    關(guān)鍵詞:TRIM39;TRIM39缺失體;新型免疫分子;禽白血病病毒

    中圖分類號(hào): S852.65+7 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2019)16-0063-04

    收稿日期:2018-04-21

    基金項(xiàng)目:中央民族大學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào):YDZXXK201618)。

    作者簡(jiǎn)介:劉妮妮(1992—),女,湖北漢川人,碩士,主要從事免疫學(xué)研究。

    通信作者:趙 珩,博士,教授,主要從事免疫學(xué)研究。

    三重基序(TRIM)蛋白幾乎存在于所有多細(xì)胞動(dòng)物中,是一個(gè)古老且數(shù)量龐大的蛋白家族[1]。隨著脊椎動(dòng)物的進(jìn)化,TRIM蛋白種類顯著增加,迄今為止僅在人類基因組中就已發(fā)現(xiàn)近70種[2]。TRIM蛋白家族成員都擁有保守的RBCC結(jié)構(gòu),從N端至C端依次為RING結(jié)構(gòu)域、1或2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域及1個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coil-coiled domin,簡(jiǎn)稱CCD)[3]。這些結(jié)構(gòu)域都具備各自的功能,RING結(jié)構(gòu)域是由10~20個(gè)氨基酸組成的鋅結(jié)合序列,研究發(fā)現(xiàn),有些TRIM蛋白能夠依賴RING結(jié)構(gòu)域發(fā)揮E3連接酶活性,如TRIM21[4]、TRIM25[5]、TRIM11[6]等;B-box結(jié)構(gòu)域同樣是鋅結(jié)合序列,目前對(duì)其功能研究還不夠清楚,但其被證實(shí)對(duì)人類免疫缺陷病毒(HIV)具有抗性,能夠影響TRIM5α對(duì)病毒的識(shí)別[7]以及TRIM15限制病毒復(fù)制的能力[8];卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域幾乎總是跟隨著B-box結(jié)構(gòu)域,它主要會(huì)影響TRIM蛋白與其他蛋白相互作用的能力[9]。另外,TRIM蛋白C端結(jié)構(gòu)域具有多樣性且在不同蛋白之間的差異較大,通常由1個(gè)或多個(gè)類型不固定的結(jié)構(gòu)域組成,根據(jù)C端結(jié)構(gòu)域的不同,TRIM蛋白還被分為11類亞家族[10]。TRIM蛋白家族具有非常廣泛的功能,參與了一系列重要的生命活動(dòng),例如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、先天性免疫調(diào)控、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等[11],在生物機(jī)體中發(fā)揮著越來越重要的作用。

    大量研究證實(shí),TRIM蛋白家族成員具有抗病毒活性,它們不僅能夠直接作用于病毒蛋白進(jìn)而限制病毒的復(fù)制,還能參與調(diào)節(jié)免疫信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12]。Stremlau等在非洲綠猴和獼猴中首次發(fā)現(xiàn)TRIM5α能夠限制Ⅰ型艾滋病病毒(human immunodeficiency virus,簡(jiǎn)稱HIV-1)的侵染[13];Hattlmann等報(bào)道TRIM21能夠與腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,簡(jiǎn)稱EMCV)蛋白酶3C、流感病毒(influenza virus,簡(jiǎn)稱IV)核蛋白(NP)相互作用,誘導(dǎo)蛋白發(fā)生泛素化降解以抑制病毒的復(fù)制[14];Bonilla等發(fā)現(xiàn),腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,簡(jiǎn)稱LCMV)致死TRIM19/PML缺失的小鼠的概率更高,說明TRIM19也具有抵病毒作用[15];另外,TRIM5/6/11/14/25/26/31/41可以限制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,簡(jiǎn)稱HBV)啟動(dòng)子增強(qiáng)劑的轉(zhuǎn)錄活性[16]。還有一些研究證明,TRIM蛋白能夠使靶蛋白發(fā)生泛素化降解或蛋白酶體降解[17-19],從而負(fù)調(diào)控免疫信號(hào)通路,如NF-κB、TLRs、RIG-Ⅰ等[20-21]。雞馬立克氏病與?MHC-B亞區(qū)有關(guān),通過對(duì)MHC-B亞區(qū)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)了許多TRIM基因,而且這些基因表現(xiàn)出極高的單核苷酸多態(tài)性(SNP),說明TRIM基因可能具有抗馬立克氏病的作用,但現(xiàn)在還沒有足夠的證據(jù)[22]。

    禽白血病病毒(avian leukemia virus,簡(jiǎn)稱ALV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae),禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬,病毒粒子的直徑為80~100 nm,由外部的囊膜和內(nèi)部電子致密的核心構(gòu)成[23],是雞群中普遍存在并常誘發(fā)腫瘤的病毒之一,其引發(fā)的禽白血病被我國(guó)政府列為二類動(dòng)物疫病。根據(jù)病毒宿主范圍、囊膜特性以及交叉中和反應(yīng)的不同,可將ALV分為A~J 10個(gè)亞群[24],其中A、B、C、D、E、J 6個(gè)亞群能夠感染雞群,在我國(guó)A、B、J亞群的感染現(xiàn)象較為普遍,它們可誘發(fā)雞群淋巴細(xì)胞瘤、纖維肉瘤、髓細(xì)胞瘤、成紅細(xì)胞瘤、骨硬化、血管瘤等不同類型的腫瘤[25],還具有破壞免疫器官、組織和細(xì)胞的能力,使機(jī)體的免疫應(yīng)答功能暫時(shí)性或永久性喪失,導(dǎo)致雞的死亡率顯著提高;另外,ALV的感染還會(huì)使雞群的生長(zhǎng)速度變緩,體質(zhì)量增加變慢,產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)下降,而且由于禽白血病病毒具有橫向及縱向傳播特點(diǎn)[26-27],加上家禽養(yǎng)殖高度集約化,使該病毒引發(fā)的禽白血病很難控制,目前尚未找到有效的防控方法,這對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究以雞TRIM39為研究對(duì)象,構(gòu)建TRIM39及其缺失體的真核表達(dá)載體,以研究TRIM39抗禽白血病病毒的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及病毒

    雞脾組織(英國(guó)劍橋大學(xué)Kaufma教授提供);禽白血病病毒(ALV)(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所張志芳研究員提供)。試驗(yàn)時(shí)間為2016年8月至2018年3月;試驗(yàn)地點(diǎn)為中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院。

    1.1.2 表達(dá)載體及菌株

    pDsRed2-C1真核表達(dá)載體為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;載體、大腸桿菌(Escherichia coli)Top10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

    1.1.3 酶和試劑

    Trizol、Oligo-dT18、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、RNase抑制劑、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、96孔酶標(biāo)板、胎牛血清素、胰酶細(xì)胞消化液、D-Hanks平衡鹽溶液、禽白血病病毒檢測(cè)試劑盒,均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。EasyTaq DNA聚合酶、DNA Marker、Pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶,均購(gòu)自NEB公司。PCR儀(Bio-Rad公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)、冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)、倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)、生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)GenBank中雞TRIM39基因序列號(hào)(NM_001006196.3),TRIM39結(jié)構(gòu)域的生物信息學(xué)分析,利用DNAMAN對(duì)TRIM39進(jìn)行比對(duì),確定TRIM39缺RING結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)位置。利用Primer 5.0軟件,依據(jù)pEGFP-N1真核表達(dá)載體及目的基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),在引物上游加入Sal Ⅰ酶切位點(diǎn),下游加入BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)。TRIM39完整序列引物為P39F:5′-ACGCGTCGACATGGATGAAGATAACCCAG-3′和P39R:5′-CGGGATCCTCA-CGGGGACAGCGTGAAGCG-3′;TRIM39ΔRING序列引物為P39ΔRINGF:5′-ACGCGTCGACATGGATGAAGATAACCCAG-3′和P39ΔRINGR:5′-CGGGATTCTCACGGGGACAGCGTGAAGCG-3′,所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2.2 目的基因的獲得

    利用改良Trizol法提取雞脾臟中的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后,分別以P39F2/P39R2、P39ΔRINGF/P39ΔRINGR、P39ΔB30.2F/P39ΔB30.2R為引物進(jìn)行TRIM39完整序列、TRIM39ΔRING序列擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括10×buffer(緩沖液)5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各2.5 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)1.5 μL、Pfu DNA聚合酶(2 U/μL)1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 36.5 μL。反應(yīng)體系:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸3 min,共34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。膠回收TRIM39基因片段,與pEASY-Blunt Simple載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli) Top10感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè),篩選陽性克隆送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

    1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

    以Sal Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切含有TRIM39的pEASY-Blunt Simple載體和 pEGFP-N1真核表達(dá)載體,分離膠純化回收目的片段。連接2個(gè)目的片段,轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè),篩選陽性克隆,提取質(zhì)粒并用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。TRIM39完整序列、TRIM39ΔRING序列以及與pDsRed2-C1真核表達(dá)載體的連接以及鑒定的具體操作方法同上。

    1.2.4 雞白血病病毒抗原(ALV-AG)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)

    用無菌管吸取細(xì)胞培養(yǎng)液,3 000 r/min離心2 min,收集上清用以檢測(cè)細(xì)胞外病毒;用D-Hanks平衡鹽溶液洗掉殘余的細(xì)胞培養(yǎng)液,用胰酶消化液將細(xì)胞懸浮起來,收集于離心管中,12 000 r/min離心2 min使細(xì)胞沉淀,棄去胰酶消化液,加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸細(xì)胞,通過反復(fù)凍融使細(xì)胞破裂釋放出細(xì)胞內(nèi)成分,3 000 r/min離心2 min,收集上清用以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒。采用禽白血病病毒檢測(cè)試劑盒,ELISA法測(cè)定ALV-AG,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外病毒濃度,具體步驟嚴(yán)格按照惠特比科技發(fā)展(北京)有限公司提供的說明書進(jìn)行。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TRIM39、TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2片段的克隆

    PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,由圖1可知,獲得的TRIM39完整序列長(zhǎng)度約為1 410 bp,TRIM39ΔRING序列長(zhǎng)度約為1 241 bp,TRIM39ΔB30.2序列長(zhǎng)度約為894 bp,與預(yù)期基因大小相符。篩選陽性克隆送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果正確,表明pEASY-Blunt Simple-TRIM39克隆載體構(gòu)建成功。

    2.2 重組表達(dá)載體pDsRed2-C1-TRIM39、pDsRed2-C1-TRIM39ΔRING、pDsRed2-C1-TRIM39ΔB30.2的鑒定

    使用菌落PCR法鑒定陽性重組子,由圖2可知,菌落PCR獲得條帶大小與PCR擴(kuò)增獲得的條帶大小一致,說明TRIM39及其突變體已經(jīng)構(gòu)建到pDsRed2-C1真核表達(dá)載體上并成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

    由圖3可知,TRIM39完整序列、TRIM39缺RING突變體、TRIM39缺B30.2突變體構(gòu)建到pDsRed2-C1的菌落PCR鑒定結(jié)果,與預(yù)期一致。圖3的左圖中TRIM39缺RING突變體條帶明顯比TRIM39缺RING突變體小,說明TRIM39缺RING突變體構(gòu)建成功;圖3的右圖中2號(hào)和7號(hào)條帶序列較TRIM39完整序列小,說明突變體構(gòu)建成功。

    2.3 禽病毒蛋白(ALV)滴度測(cè)定

    細(xì)胞攻毒后7 d進(jìn)行禽白血病病毒滴度測(cè)定,以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)、以3次平行測(cè)定的D540 nm均值為橫坐標(biāo)作圖,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線中R2達(dá)到0.988 5(補(bǔ)充材料),禽病毒蛋白濃度曲線擬合曲線符合相關(guān)性檢驗(yàn)(0

    由圖4-A可知,pDsRed2-C1-TRIM39完整序列轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞胞外禽白血病病毒濃度高于對(duì)照組但相差不大;pDsRed2-C1-TRIM39缺RING突變體轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞禽白血病病毒濃度與pDsRed2-C1-TRIM39缺B30.2突變體轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞相差不明顯且高于pDsRed2-C1-TRIM39完整序列轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞;雞胚成纖維細(xì)胞直接攻禽白血病病毒濃度較高,說明TRIM39具有一定的降低禽白血病病毒胞外分泌的作用。圖4-B可知,pDsRed2-C1-TRIM39完整序列轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞胞內(nèi)禽白血病病毒濃度明顯高于對(duì)照組;pDsRed2-C1-TRIM39缺RING突變體轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞禽白血病病毒濃度與pDsRed2-C1-TRIM39缺B30.2突變體轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞相差不明顯且明顯高于 pDsRed2-C1-TRIM39完整序列轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞;雞胚成纖維細(xì)胞直接攻禽白血病病毒濃度較pDsRed2-C1-TRIM39完整序列轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞高,且低于pDsRed2-C1-TRIM39缺B30.2突變體轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞,說明TRIM39具有一定的降低胞內(nèi)禽白血病病毒的作用。

    3 討論

    本研究通過基因重組技術(shù)獲得了雞TRIM39基因的原核表達(dá)載體,為避免基因反向插入的問題,在設(shè)計(jì)引物時(shí)有意識(shí)地引入了BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切位點(diǎn),保證了目的片段正確插入原核表達(dá)載體并與載體擁有一致的開放閱讀框。研究選用E. coli Rosetta作為表達(dá)菌株,它是一個(gè)廣泛用于表達(dá)外源蛋白的菌株,外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)受溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等的影響。首先,誘導(dǎo)溫度的高低會(huì)影響表達(dá)蛋白的溶解性,37 ℃誘導(dǎo)的上清液中可溶性蛋白含量明顯少于28 ℃誘導(dǎo)的,說明低溫條件有利于TRIM39的可溶性表達(dá),因此本試驗(yàn)中采用 28 ℃ 誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá),以獲得具有活性的可溶性蛋白用于純化,但是誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)蛋白表達(dá)量影響并不大。

    另外,本研究中采用生物信息學(xué)分析手段設(shè)計(jì)引物并成功獲得了TRIM39基因的2個(gè)突變體,即TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2。根據(jù)報(bào)道,TRIM蛋白家族對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒具有一定的抑制作用,因此本研究以禽白血病病毒為模型,研究了TRIM39、TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2蛋白對(duì)禽白血病病毒的抑制作用,發(fā)現(xiàn)三者均有抗病毒效應(yīng),但是TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2蛋白的抑制效果明顯弱于TRIM39蛋白,說明RING結(jié)構(gòu)域及B-box結(jié)構(gòu)域可能對(duì)TRIM39的抗病毒效應(yīng)有一定的影響。另外,本試驗(yàn)結(jié)果還表明,TRIM39、TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2蛋白還可能影響禽白血病病毒的細(xì)胞外釋放,而且TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2處理組細(xì)胞的病毒胞外釋放量高于TRIM39處理組,說明TRIM39的抑制作用可能通過抑制病毒的釋放實(shí)現(xiàn),但RING結(jié)構(gòu)域及B-box結(jié)構(gòu)域在此過程中是否發(fā)揮作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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