含多酶切位點(diǎn)融合黃色熒光蛋白的植物通用載體的構(gòu)建與應(yīng)用

匡琛 朱曉義 張亮 范世航 華瑋

摘要：以植物表達(dá)載體pCAMBIA3301為基本骨架，以黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，簡稱YFP）為標(biāo)簽蛋白構(gòu)建可融合目標(biāo)蛋白的表達(dá)載體，并包含可用于外源基因插入的單一識(shí)別位點(diǎn)的核酸酶酶切位點(diǎn)（Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ）。為了驗(yàn)證載體的實(shí)用性，將構(gòu)建完成的載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)GV3101農(nóng)桿菌上，進(jìn)行菌落PCR鑒定，再分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草下表皮和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，在陽性轉(zhuǎn)基因植株上均觀察到熒光，在陰性對照上沒有觀察到熒光，表明YFP標(biāo)簽蛋白在轉(zhuǎn)基因受體細(xì)胞中能夠正常表達(dá)。pCAMBIA3301：：YFP載體的成功構(gòu)建為植物蛋白亞細(xì)胞定位及過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了穩(wěn)定可靠的通用型載體資源。

關(guān)鍵詞：多酶切位點(diǎn);黃色熒光蛋白;通用載體;激光共聚焦;植物基因表征工具

中圖分類號(hào)： S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）16-0056-07

收稿日期：2018-04-04

基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2015CFB348）;國家“863”計(jì)劃（編號(hào)：2013AA102602）。

作者簡介：匡 ?。?994—），男，湖南益陽人，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ芑蚪M學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)。

通信作者：華 瑋，博士，研究員，主要從事油菜功能基因組學(xué)研究。

植物表達(dá)載體是高等植物基因功能研究中不可或缺的工具，在后基因組時(shí)代具有廣泛的應(yīng)用[1]。植物表達(dá)載體可以用來研究啟動(dòng)子元件、蛋白質(zhì)互作、亞細(xì)胞定位以及組成型表達(dá)。植物雙元表達(dá)載體的發(fā)展和不同農(nóng)桿菌菌株的選育，使得農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)得到廣泛應(yīng)用[2]。早期的植物雙元表達(dá)載體主要是由復(fù)制起始位點(diǎn)、2個(gè)T-DNA邊界重復(fù)序列之間的部分、大腸桿菌篩選標(biāo)記、目的基因與啟動(dòng)子元件及植物篩選標(biāo)記組成的。植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法有傳統(tǒng)的酶切連接法[3]和T-DNA插入法[4]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了多種新的技術(shù)，如Gateway法[5]、不依賴于基因序列和連接反應(yīng)的不依賴序列和連接的克隆方法（sequence and ligation independent cloning，簡稱SLIC）[6]、重組融合PCR技術(shù)[7]、一步克隆法[8]、基于競爭性連接原理構(gòu)建小片段基因表達(dá)載體技術(shù)[9]、無縫連接克隆In-Fusion技術(shù)[10]和快速克隆Golden Gate拼接法等[11]。綜合比較上述幾種載體構(gòu)建的生物技術(shù)，基于SLIC原理的一步克隆方法具有操作簡單、效率高、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠及適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到植物表達(dá)載體的構(gòu)建中。

pCAMBIA系列雙元表達(dá)載體是進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化最常用的表達(dá)載體之一，大多數(shù)植物功能基因組學(xué)研究所用的表達(dá)載體都以之為骨架[12-13]。植物表達(dá)骨架載體pCAMBIA3301所使用的報(bào)告基因是細(xì)菌的β-葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuronidase，簡稱GUS）。雖然GUS蛋白相對較易檢測，但是檢測底物成本高，染色過程會(huì)損傷細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，從而對細(xì)胞造成一定毒害，并且反應(yīng)中間物的擴(kuò)散會(huì)影響葡萄糖苷酶本身在細(xì)胞內(nèi)的準(zhǔn)確定位[14]?；贕US蛋白檢測的局限性，目前發(fā)展了熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)[14]。與GUS蛋白相比，熒光蛋白的檢測具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）操作簡單，在鑒定轉(zhuǎn)基因植株時(shí)，只需取樣制作臨時(shí)切片，使用熒光顯微鏡觀察有無熒光，省去了前處理等試驗(yàn);（2）可以使用活體生物發(fā)光熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行活體檢測;（3）對轉(zhuǎn)基因植株的損傷較小，目前最常用的熒光蛋白是綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，簡稱GFP），它是從維多利亞水母中分離純化出的一種可以發(fā)出綠色熒光的蛋白[15]。GFP生色基團(tuán)的形成無種屬特異性，GFP蛋白對細(xì)胞沒有毒害作用，不會(huì)影響細(xì)胞的正常生長和功能[15]。以GFP作為選擇標(biāo)記基因，可以很方便地從大量細(xì)胞或組織中篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞和植株，并可追蹤外源基因的分離或亞細(xì)胞定位。Sleight等利用Gibson法成功構(gòu)建了Cyan-Megenta-Yellow表達(dá)載體，并插入啟動(dòng)子、終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)等元件，從而編碼青色熒光蛋白（CFP）、紅色熒光蛋白（RFP）、黃色熒光蛋白（YFP）共3種熒光蛋白[16]。YFP是GFP的突變體，與GFP相比，YFP蛋白的熒光向紅色光譜偏移。GFP的最大激發(fā)波長為395 nm，最大發(fā)射波長為509 nm，而YFP的最大激發(fā)波長為514 nm，最大發(fā)射波長為527 nm[17-18]。GFP在非模式植物如油菜中的表達(dá)不穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度弱，較難觀察到熒光[19-20]。通過基因工程遺傳轉(zhuǎn)化引入YFP蛋白，較易觀察到穩(wěn)定的熒光，這可能是由于YFP存在更大的發(fā)射波長與激發(fā)波長。因此，在非模式植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，YFP蛋白更具優(yōu)勢[20-21]。

基于SLIC技術(shù)的原理，可將插入片段PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)，稱為一步克隆法，此技術(shù)的關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)帶有一步克隆酶切位點(diǎn)接頭的引物序列，即在插入片段PCR引物的5′端引入線性化克隆載體末端序列，從而使插入片段PCR產(chǎn)物的5′端和3′端分別帶有與載體2個(gè)末端對應(yīng)的一致序列（15 bp左右）。本研究利用pCAMBIA3301：：GFP（為筆者所在實(shí)驗(yàn)室用pCambia3301、pAN580載體改造而來）作為基礎(chǔ)載體。本研究用此方法構(gòu)建了用于非模式植物的多酶切位點(diǎn)遺傳轉(zhuǎn)化通用載體pCAMBIA3301：：YFP。該載體在T-DNA右邊界具有8個(gè)酶切位點(diǎn)，其中4個(gè)酶切位點(diǎn)（Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ和BamH Ⅰ）可用于插入目的基因，在T-DNA左邊界具有10個(gè)可供選擇的酶切位點(diǎn)，并且在CaMV 35S啟動(dòng)子的兩端均有多克隆酶切位點(diǎn)，可以根據(jù)需要對啟動(dòng)子進(jìn)行替換。本研究構(gòu)建的多酶切位點(diǎn)融合黃色熒光蛋白通用載體，為研究植物基因功能提供了一種有力工具。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)均于2017年6月起由筆者于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所功能基因組實(shí)驗(yàn)室與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立操作完成。雙元表達(dá)載體骨架為pEarlyGate104和pCAMBIA3301：：GFP。筆者所在實(shí)驗(yàn)室中種植野生型煙草（tobacco）溫室的培養(yǎng)條件如下：溫度為 22 ℃，光—暗周期為16 h—8 h，光照度為 110 μmol/（m2·s），濕度約為30%。質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司;凝膠回收試劑盒與大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;One Step Cloning Kit購自Vazyme公司;感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。各種生化試劑和酶分別購自Sigma公司、Thermo Science公司和生工生物工程（上海）股份有限公司等。此外，根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）提供的YFP標(biāo)簽蛋白序列（登錄號(hào)：KJ411637.1）設(shè)計(jì)本研究所用引物（表1）。

1.2 基因克隆

利用攜帶BamH Ⅰ、Bgl Ⅱ一步克隆酶切位點(diǎn)接頭的YFP-F/YFP-R引物，以gateway104：：YFP載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶有相應(yīng)一步克隆酶切位點(diǎn)接頭的YFP序列。

采用KOD（超嗜熱原始菌）菌株DNA聚合高保真酶 KOD-Plus-Neo進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系如下：10 μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo，6 μL 2 mmol/L dNTPs，2 μL 25 mmol/L MgSO4，各2 μL引物F/R（均為10 μmol/L），8 μL模板，2 μL KOD-Plus-Neo（1 U/μL），68 μL高壓滅菌蒸餾水。分裝成4管，25 μL/管。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 2 min;94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。

1.3 載體連接重組、轉(zhuǎn)化與菌落PCR初步鑒定

選擇pCAMBIA3301：：GFP合適的克隆位點(diǎn)，并對克隆載體進(jìn)行雙酶切線性化。將擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化載體進(jìn)行重組反應(yīng)，融合YFP載體的反應(yīng)體系如下：4 μL 5×CE Ⅱ Buffer（CE表示快速克隆酶），5 μL 線性化克隆載體（42 ng/μL），3 μL YFP擴(kuò)增產(chǎn)物（60 ng/μL），2 μL重組酶Exnase Ⅱ，6 μL ddH2O。體系配制完成后，用移液槍上下輕輕吹打混勻，避免產(chǎn)生氣泡。置于PCR儀中，于37 ℃反應(yīng)30 min。待反應(yīng)完成后，立即將反應(yīng)管放置在冰水浴中冷卻5 min。

將20 μL冷卻的反應(yīng)液加入200 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。于42 ℃熱激45 s，然后于冰水浴孵育2 min。再加入450 μL LB液體培養(yǎng)基，于 37 ℃ 搖菌60 min。吸取菌液均勻涂布在含有卡那霉素（100 mg/L）的固體LB平板上，將平板倒置，于37 ℃過夜培養(yǎng)。

從培養(yǎng)箱中取出平板，在超凈工作臺(tái)中，使用無菌牙簽挑取單克隆，于含有卡那霉素（100 mg/L）的固體LB平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，編號(hào)標(biāo)記并分別作為鑒定PCR反應(yīng)體系的模板，PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行電泳鑒定，觀察凝膠成像情況。

1.4 測序鑒定

選擇經(jīng)PCR鑒定正確的菌株樣品，隨機(jī)從中挑取4個(gè)單克隆，將LB液體培養(yǎng)基與卡那霉素按體積比1 000 ∶1混勻，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，送武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序，獲得測序結(jié)果后使用軟件Vector NTI Advance 1153進(jìn)行分析，判斷是否存在突變。

1.5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

根據(jù)測序結(jié)果選擇序列正確的樣品，使用Axygen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用液氮凍融法轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌，在50 μL感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞中加入5 μL質(zhì)粒（100 ng/μL），用移液槍吹打混勻后，放置于冰上5 min，再用液氮速凍1 min，于37 ℃水浴熱激5 min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)加450 μL液態(tài)LB培養(yǎng)基，于28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 h后涂布在含有卡那霉素（100 mg/L）、慶大霉素（50 mg/L）、利福平（100 mg/L）的三抗（下同）固體LB平板上，于28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落涂布在新的三抗固體LB平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，并作為菌落鑒定體系的模板。

1.6 瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)化

在超凈工作臺(tái)上，用無菌牙簽挑取鑒定正確的農(nóng)桿菌菌株，加入含有三抗的液體LB培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 h左右，D260值達(dá)到1.0。此外，從筆者所在實(shí)驗(yàn)室 -80 ℃ 冰箱中取出保存的細(xì)胞核定位marker載體 Mecheery-marker和有助于共轉(zhuǎn)化的載體p19，同時(shí)加入含有三抗的液體LB培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)6 h左右，D260值也達(dá)到1.0。吸取樣品、marker、p19三類載體菌液各2 mL，于12 000 g離心，棄上清，用轉(zhuǎn)化工作液將菌體重懸制成懸浮液。10 mL轉(zhuǎn)化工作液的配方如下：15 μL 100 mmol/L 乙酰丁香酮（AS），50 μL 0.2 mol/L 2-嗎啉乙磺酸（MES），50 μL 2 mol/L MgCl2，用去離子水補(bǔ)充總體積到 10 mL。最終轉(zhuǎn)化工作液由3種載體懸浮液按體積比 5 ∶3 ∶2 混合，即2 mL轉(zhuǎn)化體系配制方法：分別吸取1 mL懸浮液樣品，600 μL Mecheery-marker，400 μL p19，室溫靜置 2 h。選取野生型煙草4葉期的表面平整、肉質(zhì)豐滿的幼嫩葉片，用1 mL注射器將轉(zhuǎn)化工作液通過物理壓力沿著葉脈組織打入煙草葉片中，將煙草放置在溫室中正常培養(yǎng)3 d，再取葉片進(jìn)行激光共聚焦觀察。

1.7 激光共聚焦觀察

使用Nikon A1激光共聚焦平臺(tái)，以注射器針孔為圓心，取面積為1 cm2的樣品置于載玻片上，用2滴甘油封片并蓋上蓋玻片。按照標(biāo)準(zhǔn)探測模式（DU4）圖像拍攝流程采集圖像，并作相關(guān)數(shù)據(jù)分析，圖像處理軟件的版本為NIS-Elements AR 3.1。

1.8 穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)化

與瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)化類似，取經(jīng)菌落PCR鑒定正確的菌株，加入含有三抗的LB培養(yǎng)基中搖床過夜培養(yǎng)。采用Floral dip法轉(zhuǎn)化Columbia野生型擬南芥[2]，轉(zhuǎn)化工作液為200 mL水溶液體系，加入5%蔗糖及0.01%的Silwet L-77（一種有機(jī)硅表面活性劑）。待擬南芥生長到初花期（播種后約1個(gè)月），取出過夜培養(yǎng)至D260 nm為2.0左右的GV3101農(nóng)桿菌菌株，室溫、5 000 r/min離心15 min，再用轉(zhuǎn)化工作液將農(nóng)桿菌懸浮，直接將擬南芥花絮在轉(zhuǎn)化工作液中浸泡1 min，處理后澆水覆膜暗處理24 h，光照培養(yǎng)7 d后，再根據(jù)同樣的步驟轉(zhuǎn)化處理1次。在溫室中培養(yǎng)至T1代，取轉(zhuǎn)基因擬南芥花瓣置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃色熒光蛋白的克隆

利用攜帶BamH Ⅰ、Bgl Ⅱ一步克隆酶切位點(diǎn)接頭的YFP-F/YFP-R引物，以pEarlyGate104：：YFP載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶有相應(yīng)一步克隆酶切位點(diǎn)接頭的黃色熒光蛋白序列，電泳結(jié)果見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒電泳鑒定結(jié)果

采用BamH Ⅰ、Bgl Ⅱ雙酶切植物表達(dá)載體p3301：：GFP，切膠回收酶切載體片段，通過一步克隆將骨架載體與YFP連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定。由圖2可以看出，1～10號(hào)菌株鑒定結(jié)果顯示均有條帶，表明黃色熒光蛋白已經(jīng)被成功導(dǎo)入骨架載體中。由圖3、圖4可知，p3301：：YFP載體在黃色熒光蛋白標(biāo)簽上游有4個(gè)可用的常見限制性內(nèi)切酶唯一識(shí)別位點(diǎn)：Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ，這4個(gè)常規(guī)的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)在p3301：：YFP中均為單一拷貝，由此可任選2個(gè)酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)接頭的序列克隆目的基因，可以實(shí)現(xiàn)不同植物基因序列與黃色熒光蛋白基因序列的融合。

2.3 測序結(jié)果

對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，測序峰圖結(jié)果見圖5，以NCBI網(wǎng)站提供的YFP標(biāo)簽蛋白序列（登錄號(hào)：KJ411637.1）作為參考序列，使用軟件Vector NTI Advance 11.5.3進(jìn)行序列測定與拼接分析。由結(jié)果可知，YFP已被完整準(zhǔn)確地連入p3301骨架載體中，從而成功構(gòu)建出了p3301：：YFP載體。

2.4 酶切驗(yàn)證結(jié)果

為了驗(yàn)證p3301：：YFP載體酶切位點(diǎn)的可靠性，分別采用Spe Ⅰ/Bgl Ⅱ、Xba Ⅰ/Bgl Ⅱ、Sma Ⅰ/Bgl Ⅱ、BamH Ⅰ/Bgl Ⅱ雙酶切p3301：：YFP載體，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，可以獲得大小為700 bp左右的YFP標(biāo)簽蛋白片段（圖6），證明4個(gè)常見的限制性內(nèi)切酶唯一識(shí)別位點(diǎn)（Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ）準(zhǔn)確可靠。

2.5 瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)化結(jié)果

提取測序正確的p3301：：YFP載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化GV3101感受態(tài)農(nóng)桿菌，進(jìn)行煙草瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)化，得到瞬時(shí)表達(dá)的煙草植株，進(jìn)行煙草葉片激光共聚焦觀察。為了便于區(qū)分熒光蛋白，在488 nm激光器通道下拍攝模式選擇綠色，從而使得YFP激發(fā)光拍攝的圖像顯示為綠色（圖7、圖8）。激光共聚焦FITC（異硫氰酸熒光素）通道下觀察到Y(jié)FP激發(fā)光，表明標(biāo)簽蛋白YFP可以在植物體內(nèi)進(jìn)行組織泛表達(dá);激光共聚焦 561 nm 激光器通道下觀察到核定位mCherry紅色熒光蛋白激發(fā)光，可以直接指明細(xì)胞核覆蓋區(qū)域;激光共聚焦明場通道圖像顯示出植物細(xì)胞區(qū)域;通過FITC與TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）雙通道復(fù)合圖像，能夠觀察到Y(jié)FP與mCherry紅色熒光蛋白可以共定位表達(dá)并在細(xì)胞核區(qū)域疊加顯示黃色，表明YFP在煙草植株體內(nèi)成功表達(dá)（圖7）。

2.6 載體在轉(zhuǎn)基因擬南芥組織細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)

為了進(jìn)一步研究載體p3301：：YFP在轉(zhuǎn)基因植物組織中的穩(wěn)定表達(dá)情況，本研究觀察了轉(zhuǎn)基因擬南芥花瓣周圍細(xì)胞中黃色熒光蛋白的表達(dá)。在轉(zhuǎn)p3301：：YFP擬南芥株系的花瓣等色素積累較少的器官中觀察到強(qiáng)烈的熒光，而在野生型對照植株中均未觀察到熒光，說明植物表達(dá)載體p3301：：YFP攜帶的YFP在模式植物擬南芥中能夠整合并穩(wěn)定表達(dá)（圖8）。

3 討論

植物功能蛋白與熒光蛋白的融合表達(dá)是研究功能蛋白在植物細(xì)胞體內(nèi)定位及其運(yùn)動(dòng)特征的有力手段。綠色熒光蛋白由于能夠自發(fā)產(chǎn)生熒光團(tuán)，因此被廣泛用作分子和細(xì)胞生物學(xué)的熒光標(biāo)記。早期應(yīng)用的野生型GFP基因具有一定不足，如GFP不僅具有2個(gè)激發(fā)峰，從而降低了檢測特異性，而且其長波激發(fā)峰的強(qiáng)度較低，不易觀察。在GFP所有的突變體中，黃色熒光蛋白具有最長的波長，在分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中可以用于構(gòu)成有用的探針，因此YFP的應(yīng)用范圍更廣。本研究將pAN580：：GFP載體中的GFP與p3301：：YFP載體中的YFP比對后發(fā)現(xiàn)，克隆的YFP相對于GFP有9個(gè)堿基發(fā)生突變，分別是第69位的G突變成A，第197、198位的AC突變成GG，第205位的G突變成C，第217、218位的AG突變成GC，第610、611位的AC突變成TA，第695位的A突變成T，從而導(dǎo)致5個(gè)氨基酸發(fā)生變化，分別是第66位的蘇氨酸（ACC）突變成丙氨酸（GCC），第69位的纈氨酸（GTG）突變成亮氨酸（CTG），第73位的絲氨酸（AGC）突變成（GCC）丙氨酸，第204位的蘇氨酸（ACC）突變成酪氨酸（TAC）以及第232位的組氨酸（CAC）突變成（CTC）亮氨酸。本研究用5個(gè)位點(diǎn)突變的YFP替換GFP基因片段，成功地構(gòu)建了新型植物雙元表達(dá)載體p3301：：YFP，其表達(dá)產(chǎn)物不需要其他底物或者輔助因子即可被檢測。YFP替換GFP后熒光活性大大增強(qiáng)。本研究將p3301：：YFP載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)均觀察到強(qiáng)烈的熒光，表明載體的高效可靠性。

用于遺傳轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體需要質(zhì)粒攜帶的目的基因與融合標(biāo)記基因能夠與宿主的染色體整合并表達(dá)[22-25]。高效的雙元表達(dá)載體有利于高等植物基因的功能分析，如啟動(dòng)子分析[26]、基因沉默和蛋白質(zhì)定位的熒光蛋白融合分析。如果多克隆位點(diǎn)中具有唯一的限制性酶切位點(diǎn)，將便于啟動(dòng)子的置換。遺傳編碼的熒光標(biāo)簽是蛋白質(zhì)序列，可以融合到目的蛋白中使其激發(fā)熒光。在分子生物學(xué)研究中，植物表達(dá)載體資源遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于動(dòng)物、微生物載體資源，本研究構(gòu)建的植物融合表達(dá)載體p3301：：YFP含有目的基因必需的啟動(dòng)子及終止子，同時(shí)含有4個(gè)可用常見限制性內(nèi)切酶單一識(shí)別的位點(diǎn)，為外源目的基因引入提供了12種選擇，具有更好的應(yīng)用價(jià)值。此外，本研究通過接頭引物PCR法[27]、基于SILC原理一步克隆等方法構(gòu)建p3301：：YFP，與使用商業(yè)化T載體TOPO和gateway法構(gòu)建植物表達(dá)載體相比，具有以下顯著的優(yōu)點(diǎn)：（1）操作簡單，使用進(jìn)口商業(yè)化載體前后需要經(jīng)過2次細(xì)菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)與菌落PCR鑒定，而通過本研究方法僅需1次;（2）成本較低，商業(yè)化TOPO載體費(fèi)用較高，進(jìn)口品牌昂貴，若使用 In-Fusion 技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體，進(jìn)口試劑盒極為昂貴，而本研究方法使用的國產(chǎn)品牌價(jià)格實(shí)惠，僅為進(jìn)口試劑盒的1/10左右;（3）陽性率高，商業(yè)化TOPO載體假陽性率較高，容易出現(xiàn)目的基因5′端與3′端連反的現(xiàn)象，而本研究方法經(jīng)過雙酶切并不會(huì)出現(xiàn)連反現(xiàn)象。利用本研究方法構(gòu)建的植物表達(dá)載體，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。但是，本方法在目的基因兩端加酶切接頭時(shí)，可能導(dǎo)致引物退火溫度偏高，從而影響特異性目的片段的獲得，使得本方法在應(yīng)用上具有一定的不足。

綜上所述，本研究構(gòu)建的多酶切位點(diǎn)融合黃色熒光蛋白通用載體，為研究人員提供了操作簡單、效率高、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且適用范圍廣的亞細(xì)胞定位研究與功能分析工具。植物表達(dá)載體p3301：：YFP在啟動(dòng)子上游、多克隆位點(diǎn)、終止子下游分別有3、4、2個(gè)單一拷貝限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。該載體可用于不同外源目的基因和不同蛋白功能表達(dá)載體的快速一步克隆構(gòu)建，完成外源基因與宿主植株的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，進(jìn)行亞細(xì)胞定位，為植物的基因功能研究與遺傳轉(zhuǎn)化提供了新的通用型植物表達(dá)載體工具。

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