基于線粒體基因nd5對(duì)長(zhǎng)江上游黑尾近紅鲌遺傳多樣性分析

嚴(yán)太明，王雄延，羅 杰，李 松，張 騫，何 亮，張松培，何佳洋，何 智

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130）

黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda），隸屬于鯉科（Cyprinidae）、鲌亞科（Cultrinae）、近紅鲌屬（Ancherythroculter），是長(zhǎng)江上游特有魚類，主要分布于四川和重慶境內(nèi)的長(zhǎng)江干流及其支流[1-3]。近年來，由于過度捕撈、水利水電工程修建、水體污染和其他人為因素的影響，黑尾近紅鲌種群數(shù)量急劇下降[4-6]?；跍缃^風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)（ERI）和優(yōu)先保護(hù)程度分析發(fā)現(xiàn)，急需對(duì)長(zhǎng)江上游黑尾近紅鲌采取保護(hù)措施[7-8]。

遺傳多樣性研究結(jié)果能為制定科學(xué)有效的物種保護(hù)策略提供重要信息[9-10]?；诰€粒體基因cytb，Liu H.Z.等[5，11]發(fā)現(xiàn)龍溪河、習(xí)水河和木洞河黑尾近紅鲌群體遺傳多樣性水平較高，而其遺傳多樣性水平有明顯的下降。人工大壩的修建改變了支流群體與干流群體間的基因交流方式，棲息地環(huán)境的破壞、過度捕撈等導(dǎo)致的種群數(shù)量快速下降，可能是物種遺傳多樣性在短期內(nèi)顯著降低的主要原因[12]。因此，為評(píng)價(jià)既有保護(hù)措施的有效性和實(shí)施有針對(duì)性的保護(hù)策略，有必要對(duì)黑尾近紅鲌的遺傳資源現(xiàn)狀進(jìn)行再評(píng)估。

本研究采集了長(zhǎng)江干流合江段、支流龍溪河和瀨溪河野生黑尾近紅鲌樣本，對(duì)其線粒體NADH脫氫氧化酶亞基5（NADH dehydrogenase subunit 5，nd5）序列的擴(kuò)增和分析，評(píng)估了其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀，旨在明確支流和干流種群以及支流種群間是否存在遺傳分化，以期為黑尾近紅鲌野生資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

89 個(gè)野生黑尾近紅鲌樣本于2016年7月—2017年11月分別采自長(zhǎng)江干流合江段（HJ），長(zhǎng)江一級(jí)支流龍溪河（LOR）以及沱江（長(zhǎng)江的一級(jí)支流）一級(jí)支流瀨溪河（LAR）（圖1），采集地信息見表1。對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定后，取胸鰭保存于無水乙醇中，備用。

表1 黑尾近紅樣本基本信息Table 1 Sample information of A.nigrocauda populations

1.2 DNA提取

取胸鰭組織約100 mg，加入600 μL 組織裂解液（0.01 M Tris-HCl，pH 8.0；0.1 M EDTA；5 g/L SDS）勻漿后加入 10 μL 蛋白酶 K（10 mg/mL），56 ℃消化5 h 后，酚-氯仿法抽提基因組 DNA[13]。用 30 μL 1×TE Buffer 溶解乙醇沉淀后的DNA 樣品，-20 ℃保存，備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI 報(bào)道的黑尾近紅鲌線粒體基因組全序列（GenBank 登錄號(hào)：KC513573），利用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì) nd5 序列引物（F：GTTCATCCATTGGTCTTAGG，R：CTCGTTGAATGTCGCTTGTA），并送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系為 40.0 μL，其中包括 2×Taq PCR Master Mix（成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司）20.0 μL，上、下游引物各 2.0 μL（10 mM），模板 DNA 4.0 μL，加雙蒸水至總體積 40.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；然后35 個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括 94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成目的片段回收及測(cè)序。

圖1 黑尾近紅鲌樣點(diǎn)分布圖Figure 1 The sampling locations of A.nigrocauda

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用DNAstar 軟件對(duì)所得序列進(jìn)行校對(duì)和拼接，并在此基礎(chǔ)上使用MEGA 7.0 進(jìn)行堿基組成統(tǒng)計(jì)、群體間遺傳距離的計(jì)算；使用DnaSP 5.0 軟件計(jì)算各群體的單倍型數(shù)（n）、變異位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性（h）、核苷酸多樣性（π）和基因流（Nm）等；Arlequin 3.5 軟件計(jì)算群體間遺傳分化系數(shù)（Fst），并進(jìn)行群體AMOVA 分析。MrBayes 3.1.2 結(jié)合 Modeltest 3.7 構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 核苷酸組成

獲得黑尾近紅鲌nd5 基因序列長(zhǎng)度為1 668 bp。如表2所示，nd5 基因序列總體變異率為0.30%，其中，長(zhǎng)江干流HJ 群體的變異率高于支流。89 條序列間存在2 個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，3 個(gè)單一信息位點(diǎn)和2個(gè)插入/缺失位點(diǎn)，各群體堿基組成表現(xiàn)出明顯的A+T 偏倚性（56.4%）。

表2 黑尾近紅 鲌nd5 核苷酸序列特征Table 2 Sequence characteristics of nd5 in A.nigrocauda

2.2 遺傳多樣性分析

由表3可知，黑尾近紅鲌整體呈現(xiàn)低單倍型多樣性（h）和低核苷酸（π）的特點(diǎn)，其中，LAR 群體的單倍型多樣性最高（0.662），HJ 群體的單倍型多樣性最低（0.571）；HJ 群體核苷酸多樣性最高（0.000 69），LOR 群體最低（0.000 45）。如圖2所示，基于 nd5 序列共檢測(cè)到6 個(gè)單倍型，HJ 群體所特有的單倍型數(shù)目最多，Hap-1 為3 個(gè)地理群體共享單倍型，Hap-2為L(zhǎng)AR 群體與HJ 群體共享，其他單倍型為單個(gè)群體所特有。

表3 黑尾近紅 鲌nd5 基因遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity indices of nd5 in A.nigrocauda populations

圖2 黑尾近紅鲌nd5 單倍型分布圖Figure 2 Haplotypes distribution in A.nigrocauda populations based on mitochondrial nd5 sequences.

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

遺傳分化系數(shù)的結(jié)果顯示，黑尾近紅鲌兩兩群體間的 Fst值（0.055 54～0.448 28）差異顯著（P＜0.01，表4）。LOR-LAR 群體間的 Fst值最大，LOR-HJ 群體間的 Fst值最?。ū?），這表明 LOR 群體與 HJ 群體間的遺傳關(guān)系較近。LOR 群體與HJ 群體間的基因流較大（Nm＞1），LAR 群體與 LOR 和 HJ 群體間的基因流較?。∟m＜1），這表明 LOR 群體和 HJ 群體存在明顯的基因交流。分子變異方差分析（AMOVA）表明，分子變異主要來自群體內(nèi)部（76.12%，表5）。

基于nd5 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，盡管有少數(shù)黑尾近紅鲌個(gè)體的聚類與他們的地理來源不一致，但大部分個(gè)體仍是按照他們的地理來源聚類（圖3）。

3 討論

本研究中黑尾近紅鲌3 個(gè)群體的單倍型多樣性（0.412）和核苷酸多樣性（0.000 27）均低于Liu H.Z.等[11]和劉春池等[5]在龍溪河、習(xí)水河和木洞河的研究結(jié)果，同時(shí)也表現(xiàn)出兩個(gè)支流群體（LOR 和LAR）的單倍型數(shù)量和核苷酸多樣性均顯著低于干流群體（HJ，表3）。棲息地破壞、過度捕撈和修建人工水壩等人為活動(dòng)是造成魚類遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)不可逆轉(zhuǎn)性惡化的主要因素[14-15]，這可能是黑尾近紅鲌遺傳多樣性水平下降的主要原因。3 個(gè)黑尾近紅鲌種群的棲息環(huán)境相差較大，長(zhǎng)江干流水流量大，河流形態(tài)、生態(tài)環(huán)境、水生生物多樣性和河流連續(xù)性均優(yōu)于支流[16-17]，支流生態(tài)環(huán)境的脆弱，過度捕撈、環(huán)境污染等人為干擾對(duì)其種群數(shù)量所產(chǎn)生的影響較大。近年來黑尾近紅鲌野生資源量呈急劇下降的趨勢(shì)，種群數(shù)量的銳減可能是導(dǎo)致遺傳多樣性快速丟失的主要原因。

表4 黑尾近紅 鲌群體內(nèi)遺傳距離（對(duì)角線，粗體）、群體間遺傳距離（對(duì)角線下）和遺傳分化系數(shù)F（st對(duì)角線上）Table 4 Genetic fixation index (Fst) (above diagonal) and genetic distance within (diagonal)and between (below diagonal) A.nigrocauda populations

表5 黑尾近紅 鲌群體分子變異分析結(jié)果Table 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) for the A.nigrocauda populations

圖3 黑尾近紅鲌nd5 基因Bayes 系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic trees of the nd5 sequence of A.nigrocauda reconstructed with Bayesian inference.

淡水魚類種群很容易受棲息地環(huán)境改變、水體污染、水利水電工程的修建和外來物種入侵等因素的影響，從而導(dǎo)致生物多樣性下降[18-20]。近年來，在遼河修建了很多引水工程，雖然短期內(nèi)對(duì)魚類群體沒有影響，但長(zhǎng)期以來會(huì)導(dǎo)致瀕危物種生物多樣性降低甚至滅絕[20]。本研究結(jié)果結(jié)合先前的研究結(jié)果表明[5，11]，在最近 10 多年，研究區(qū)域內(nèi)黑尾近紅鲌的遺傳多樣性下降明顯。龍溪河和瀨溪河是黑尾近紅鲌的主要棲息地，他們分別是長(zhǎng)江和沱江的一級(jí)支流，水利水電設(shè)施的修建使得支流中的黑尾近紅鲌與長(zhǎng)江干流群體僅能進(jìn)行單向的基因交流。同時(shí)，龍溪河與瀨溪河流經(jīng)的城鎮(zhèn)較多，魚類棲息環(huán)境受生活污染、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等人類活動(dòng)的影響較大[4，11，21]，遺傳多樣性丟失的速度更快。

遺傳分化分析結(jié)果表明，3 個(gè)種群間存在顯著的遺傳分化（0.055 54～0.448 28，表4），群體內(nèi)的變異程度高于群體間（表5）。黑尾近紅鲌產(chǎn)粘性卵，受精卵就地孵化發(fā)育，幼魚和成魚沒有長(zhǎng)距離遷移特性，黑尾近紅鲌的這些特性可能有助于地理種群間的遺傳分化。但是，HJ 群體與 LOR、LAR 群體的取樣地分別相距大約82 km 和126 km，如此短的地理距離，黑尾近紅鲌的產(chǎn)卵習(xí)性等是否是其種群間出現(xiàn)遺傳分化的主要原因，還待進(jìn)一步確認(rèn)。此外，在龍溪河和瀨溪河上分別建有7 個(gè)和5 個(gè)人工大壩，并且這些大壩最早建于20 世紀(jì)20年代，嚴(yán)重阻礙了黑尾近紅鲌群體間的基因交流，特別是向上基因交流已不可能，因此人工大壩可能也是導(dǎo)致這些種群分化的一個(gè)重要原因。從目前的大壩分布情況來看，LOR 群體和LAR 群體可以向下與HJ 群體進(jìn)行基因交流，但LOR 群體和LAR 群體間幾乎完全阻隔，并且LOR 群體和LAR 群體之間的Fst值最大，這也反映了大壩目前的阻隔形勢(shì)嚴(yán)峻。同時(shí)，支流小種群間的遺傳漂變和快速的基因丟失也可能加速了種群間的遺傳分化[22]。但是，這些大壩的阻隔并不完全，3 個(gè)種群間存在一定程度的基因交流（表4），比如支流向下單向基因交流必然存在，同時(shí)大壩阻隔時(shí)間還相對(duì)較短，因此系統(tǒng)進(jìn)化分析中，少數(shù)個(gè)體并沒有與其自身地理種群聚類（圖3）。

綜上所述，長(zhǎng)江上游黑尾近紅鲌群體的遺傳多樣性下降明顯，急需對(duì)其開展保護(hù)工作。雖然干流群體表現(xiàn)出較高的單倍型多樣性水平，在黑尾近紅鲌群體的遺傳保護(hù)中扮演了重要角色，但是支流種群具有種群特有的單倍型，且與干流種群的遺傳多樣性水平差異顯著，同時(shí)，支流群體能對(duì)干流種群形成較好的資源補(bǔ)充。因此，本研究認(rèn)為干流和支流都應(yīng)是黑尾近紅鲌重要的保護(hù)單元。