新雜合抗結(jié)核藥物的合成及抗菌活性

祝 宏，曾祥聰，丁 嬌，李 麗 ，馬 俊，張 煥 ，劉 慧*

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.武漢市金銀潭醫(yī)院，湖北 武漢 430023

結(jié)核病是一種傳染性強(qiáng)、難治愈、發(fā)病率、致死率高的的疾病，而中國是感染人群最多且死亡率較高的國家［1］。結(jié)核桿菌是結(jié)核病的病原體，可攻擊人的組織及器官，近年來藥物的使用頻繁，導(dǎo)致耐藥結(jié)核桿菌及耐多藥結(jié)核桿菌的產(chǎn)生［2］，為滿足臨床的需求，需要采取措施來預(yù)防和抗結(jié)核藥物的創(chuàng)新。在新藥研究與開發(fā)上，雜合物越來越受重視，對(duì)其的研究和開發(fā)也越來越多，通過化學(xué)反應(yīng)將不同的連接基團(tuán)的兩個(gè)分子連接起來合成雜合藥物，形成的藥物或具有兩者的性質(zhì)。分子中的兩類藥物的藥效部位各自與不同的靶標(biāo)結(jié)合，多靶點(diǎn)給藥，減緩耐藥性速率［3］；強(qiáng)化藥理作用，減弱相應(yīng)的毒副作用；或發(fā)揮各自的藥理活性，協(xié)同完成治療效用［4］，發(fā)揮藥物的最大藥效，降低藥物的耐藥率，延遲耐藥的周期。

水楊酸類藥物是應(yīng)用最早，最廣和最普通解熱鎮(zhèn)痛藥，Ratnasinghe等［5］在調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，服用阿司匹林可以降低肺癌的死亡率。異煙肼是一種全能殺菌藥，乙胺丁醇是人工合成的一種阿拉伯糖類抗結(jié)核藥，兩者均用于臨床是治療結(jié)核病的重要一線藥物，具有殺菌力強(qiáng)、選擇性高、副作用少的優(yōu)點(diǎn)。雜合反應(yīng)在藥物合成中有著廣泛的應(yīng)用，在雜合藥物的制備過程中，酰化反應(yīng)在治療結(jié)核病領(lǐng)域有著重要作用。通過成酯、成酰胺等修飾可以改變?cè)瓉硭幬锏睦砘再|(zhì)、降低毒副作用、改善藥物的體內(nèi)代謝、提高療效等來減弱藥物的耐藥性［6-8］。在蛋白質(zhì)中酰胺鍵是關(guān)鍵的化學(xué)鍵，也是合成其他高分子材料的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，具有極性大、穩(wěn)定性好和結(jié)構(gòu)多樣性等性質(zhì)，成為有機(jī)化學(xué)分支中最普遍和應(yīng)用最廣的官能團(tuán)之一，但很多簡(jiǎn)單的酰胺其實(shí)是很難合成的［9-11］。根據(jù)以上分子設(shè)計(jì)原理，本文合成了兩種抗結(jié)核類衍生物（見圖1），這類化合物的抗結(jié)核桿菌研究還是較新的領(lǐng)域，有巨大潛在的研究意義。

圖1 乙酰水楊酸、異煙肼和乙胺丁醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of acetylsalicylic acid，isoniazid and ethambutol

乙酰水楊直接與異煙肼及乙胺丁醇反應(yīng)活性很低，產(chǎn)物的收率也很低，需要對(duì)反應(yīng)過程進(jìn)行改進(jìn)。根據(jù)乙酰水楊酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)上有裸露的羧基，碳原子部分會(huì)顯正電性，羧酸是弱的酰化基，在反應(yīng)過程中需要加入催化劑使羧酸形成活性中間體，增強(qiáng)反應(yīng)活性。異煙肼分子結(jié)構(gòu)中的肼基，有比較強(qiáng)的親核能力，容易進(jìn)行酸胺縮合反應(yīng)。乙酰水楊酸和異煙肼進(jìn)行酸胺縮合反應(yīng)，在反應(yīng)的過程加入二環(huán)已基碳二亞胺，與乙酰水楊酸形成活性酰胺，發(fā)生親核取代反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)過程加入催化量的催化劑p-二甲氨基吡啶［12］和DCC上有孤對(duì)電子進(jìn)攻羰基C，獲得氫后離去得酰胺產(chǎn)物9；進(jìn)攻羥基氫生成過渡態(tài)，經(jīng)質(zhì)子作用脫水，再脫去質(zhì)子得到?；a(chǎn)物13（見圖2和圖3）。

圖2 乙酰水楊酸-異煙肼的合成路線Fig.2 Synthesis route of acetylsalicylic acid-isoniazid

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器的廠家

異煙肼（天津市博迪化工有限公司）；乙胺丁醇（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司）；其余反應(yīng)所用的試劑均為分析純，并按要求進(jìn)行純化處理。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌；AB204-N型電子天平；ZF 7三用紫外分析儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52C；Mercury Plus 400超導(dǎo)核磁共振儀；Nicolet5700型傅里葉紅外光譜儀，KBr壓片；UltiMate3000戴安高效液相色譜儀；Thdermo Trace GC ULTRA DSQ II型氣質(zhì)連用儀；Agilent 6460 LC/MS液質(zhì)聯(lián)用儀。

圖3 乙酰水楊酸-乙胺丁醇的合成路線Fig.3 Synthesis route of acetylsalicylic acid-ethambutol

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目標(biāo)化合物9和13的合成 稱取0.66 g（3.66 mmol）乙酰水楊酸以及 0.50 g異煙肼（3.64 mmol）溶于15mLN，N-二甲基甲酰胺中，在30℃條件下磁力攪拌，加入0.75 g除水劑二環(huán)己基碳二亞胺和0.02 g催化劑4-二甲氨基吡啶（異煙肼質(zhì)量的5%～10%），溶液變成黃色，保溫反應(yīng)12h，用薄層層析硅膠板跟蹤反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，過濾。將濾液緩慢滴加至120mL冰水中，邊加邊攪拌，將得到的混合液再次抽濾，濾餅用冰水洗滌1～3次，再用飽和NaCl溶液洗滌1次，最后將濾餅轉(zhuǎn)入真空干燥器中充分干燥，得到目標(biāo)產(chǎn)物淡黃色化合物9。分析計(jì)算可知，產(chǎn)品收率為87.50%。

乙酰水楊酸-異煙肼（9）：淡黃色固體；m.p.115 ～120；IR（ KBr，cm－1）：3248.82，2857.15，1675.95，1659.45，1501.37，1620.42，11449.13，1130.34，951.78，751.29 ；1 H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：6.90（m，1H），7.03（m，1H），7.27（m，1H），7.10（s，1H），2.93（d，1H），2.93（d，1H），2.31（d，3H），2.55（m，1H），2.93（d，1H），2.93（d，1H），3.16（dd，1H）；HRMS-ESI（m/z）calculated for［M+H+］：299.09，found：299.89。

稱取0.44 g（2.44 mmol）乙酰水楊酸和 0.50 g（2.45 mmol）乙胺丁醇溶于15mL二甲亞砜中，在30℃條件下磁力攪拌，加入0.50 g除水劑二環(huán)己基碳二亞胺和0.03 g催化劑4-二甲氨基吡啶（乙胺丁醇質(zhì)量的5%～10%），溶液變成白色，保溫反應(yīng)12h，用薄層層析硅膠板跟蹤反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，過濾。待反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液緩慢滴加至120mL水中，邊加邊攪拌，將得到的混合液用二氯甲烷反復(fù)萃取3次，萃取所得有機(jī)相依次用水、飽和NaCl溶液各洗滌1次，向洗滌后的有機(jī)相中加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，靜置0.5h后旋干，得到目標(biāo)產(chǎn)物白色化合物13。分析計(jì)算可知，產(chǎn)品收率為86.35%。

乙酰水楊酸-乙胺丁醇（13）：白色固體；m.p.120～125；IR（ KBr，cm-1）：3342.36，2926.48，1733.69，1606.30，1102.36，1047.68，757.59；1 H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：6.91（m，1H），7.04（s，1H），9.45（m，1H），7.25（m，1H），7.43（d，1H），2.32（s，3H），4.27（s，2H），3.4（m，1H），1.34（s，2H），1.02（s，3H），1.91（d，1H），2.15（m，2H），2.15（m，2H），1.91（d，1H），2.34（s，1H），2.32（d，2H），0.73（s，3H），3.47（d，2H），1.91（d，1H）；HRMS-ESI（m/z）calculated for［M+H+］：366.22；found：405.22。

2 生物活性測(cè)試

2.1 測(cè)試方法

抑菌活性試驗(yàn)用抗結(jié)核藥物的7H9培養(yǎng)基，由武漢市金銀潭醫(yī)院提供。化學(xué)試劑二甲基亞砜、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Tween-80、甲醇、去離子水為分析純，購自國藥化學(xué)試劑有限公司。用不含抗結(jié)核藥物的7H9培養(yǎng)基作空白對(duì)照。采用微孔顯色法及盲法編排測(cè)試。

稱取乙酰水楊酸、異煙肼、乙胺丁醇、乙酰水楊酸-異煙肼和乙酰水楊酸-乙胺丁醇各50 mg，用去離子水分別溶解，再轉(zhuǎn)移至50mL的容量瓶用去離子水定容，分別配成1.0 mg/mL濃度的藥液，以0.5 mg/mL為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試的最大濃度，濃度依次往下做對(duì)倍稀釋。

2.2 測(cè)試結(jié)果

以不加抗結(jié)核藥原液的培養(yǎng)基為對(duì)照組，隨著時(shí)間推移，觀察培養(yǎng)基的顯色情況，培養(yǎng)基的顯色情況反映了HR37V標(biāo)準(zhǔn)株的生長情況，進(jìn)一步說明了藥物對(duì)結(jié)核桿菌的敏感性［12］。R為對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，即無活性；S為對(duì)結(jié)核分枝桿菌的敏感性，即為有活性（質(zhì)量濃度單位為μg/mL），培養(yǎng)基能顯示藍(lán)色的最低濃度為藥物的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）［13］值，結(jié)果見表 1。

表1 目標(biāo)化合物的抑菌活性Tab.1 Antibacterial activity of target compounds

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物的合成

乙酰水楊酸-異煙肼的合成，實(shí)質(zhì)就是羧酸中的羥基被氨基取代而生成酰胺的反應(yīng)，可以阻止和延緩異煙肼在體內(nèi)的乙酰化；乙酰水楊酸-乙胺丁醇的合成，實(shí)質(zhì)就是羧基和羥基生產(chǎn)脂的反應(yīng)，并起到協(xié)同的抗菌作用，減弱藥物的耐藥率，合成抗結(jié)核桿菌且具有抗耐藥的藥物分子。更重要的是乙酰水楊酸-異煙肼和乙酰水楊酸-乙胺丁醇都可以通過“一鍋法”［14-16］反應(yīng)得到，操作簡(jiǎn)單易實(shí)施，可以利用廉價(jià)易得的試劑在溫和條件下獲得良好收益的目標(biāo)產(chǎn)物，收率高，且該反應(yīng)應(yīng)用范圍廣，同時(shí)催化劑也可回收使用，潛在應(yīng)用巨大。

3.2 譜圖分析

目標(biāo)化合物乙酰水楊酸-異煙肼的IR圖譜（見圖4），3248.82 cm-1、3244.7 cm-1為酰胺基 N-H鍵彎曲振動(dòng)吸收峰，1675.95 cm-1為 C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰?；衔镆阴Ｋ畻钏?異煙肼的1H NMR（d6-二甲基亞砜作溶劑）圖譜化學(xué)位移在δ=2.93為酰胺基NH氫吸收峰；目標(biāo)化合物乙酰水楊酸-乙胺丁醇的IR圖譜（見圖5），1733.69 cm-1為酯基R-CO-OR伸縮振動(dòng)吸收峰，1047.68 cm-1為-OH的吸收峰?；衔镆阴Ｋ畻钏?乙胺丁醇的1H NMR（d6-二甲基亞砜作溶劑）圖譜化學(xué)位移在δ=1.91為OH氫吸收峰，化學(xué)位移在δ=2.15為NH氫吸收峰。

圖4 乙酰水楊酸-異煙肼：（a）紅外圖譜，（b）核磁共振氫譜Fig.4 Acetylsalicylic acid-isoniazid：（a）IR spectrum，（b）1H NMR

圖5 乙酰水楊酸-乙胺丁醇：（a）紅外圖譜，（b）核磁共振氫譜Fig.5 Acetylsalicylic acid-ethambutol：（a）IR spectrum，（b）1H NMR

4 結(jié) 語

采用氧化還原指示劑顯色法來檢測(cè)結(jié)核桿菌的耐藥性，通過指示劑由氧化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)過程中顏色變化判斷藥物的敏感性。初篩結(jié)果顯示：目標(biāo)化合物9和13顯示出較好的殺菌活性，其中13的殺菌效果相對(duì)于9而言，有更強(qiáng)的的殺菌效果。此外，這個(gè)反應(yīng)對(duì)環(huán)境友好、條件溫和、成本低，其原理和機(jī)理可應(yīng)用于藥物分子合成，催化方法給化學(xué)反應(yīng)提供了新的可能，對(duì)抗結(jié)核藥物及抗耐藥性的衍生物的設(shè)計(jì)和合成具有一定的意義。