冠心寧片通過PI3K/AKT信號通路抑制慢性心力衰竭小鼠心肌細胞凋亡

齊月寒，馬全鑫，徐松濤，郁 晨，陳姣姣，方明筍，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學，中醫(yī)藥科學院/比較醫(yī)學研究所，杭州 310053)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，是21世紀主要的心血管疾病之一[1]。CHF病因復雜，心肌細胞凋亡在 CHF的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是心肌發(fā)生損害的重要形式，會導致心肌收縮功能下降，使CHF發(fā)生進行性惡化，臨床上往往表現為左心室功能障礙[2-3]。

冠心寧片由丹參、川芎組成，具有活血化瘀、通脈養(yǎng)心之功效，是同類藥品冠心寧注射液相同處方經提取工藝改進后制成的口服中藥制劑。本課題組前期研究發(fā)現，冠心寧片的藥理作用有：糾正心臟自主神經調控功能紊亂，防止心律失常的發(fā)生[4]；提高血漿NO濃度，有明顯的擴血管作用[5-6]；有效減少心肌耗氧量，有利于調節(jié)和維持心肌缺血(缺氧)狀態(tài)下正常氧代謝及能量的供需平衡[7]。基于以上的研究結果，本課題組推測冠心寧片可能對CHF有一定的改善作用，因此，利用主動脈弓縮窄術建立小鼠CHF模型，觀察冠心寧片對心功能的改善作用，檢測心肌細胞凋亡水平及相關信號通路的變化，探討冠心寧片可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級雄性ICR小鼠80只，7～8周齡，來源于上海斯萊克實驗有限公司[SCXK (滬) 2017-0005]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心屏障實驗室[SYXK(浙) 2018-0012]，環(huán)境溫度: (22 ± 2)℃，相對濕度: 50%～60%，光照: 12 h/12 h明暗交替; 在IVC籠內飼養(yǎng)，自由飲食。在實驗過程中按實驗動物使用的“3R”原則給予人道的關懷。浙江中醫(yī)藥大學實驗動物倫理審查委員會通過(ZSLL-2018-064)。

1.1.2 實驗藥物

冠心寧片(GXNT)浸膏粉，性狀：淡棕色粉末，由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供，密封避光、陰涼處保存。

卡托普利片(Captopril，CPT)，性狀：白色片劑，購自杭州民生藥業(yè)，國藥準字：H33022466。

1.2 主要試劑與儀器

TUNEL 細胞凋亡染色試劑盒，購自羅氏公司；總RNA提取試劑盒，逆轉錄試劑盒，SYBR Green RT-PCR染料均購自Takara公司；總蛋白提取試劑盒，購自南京凱基公司；全自動蛋白定量分析試劑盒(12～230×103)，購自Protein Simple公司；使用以下抗體：anti-PI3K(CST，#4257)、anti-p-AKT(CST，#4060)、anti-AKT(CST，#4691)、anti-BAX(CST，#14796)、anti-BCL2(CST，#3869)、anti-β-actin(CST，#3869)。

Vevo1100 小動物超聲影像系統(tǒng)(日本 Fujifilm 公司)；Thermo 多功能酶標儀(美國 Thermo 公司)； HM335E 半自動石蠟切片機(德國 Microm 公司)；WES全自動蛋白定量分析儀(美國Protein Simple公司)，Nana Zoomer 2.0 RS 數字切片掃描設備(日本濱松公司)；Step One Plus實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)，自動染色機(德國 Leica 公司)，小動物麻醉呼吸麻醉機(美國Summit 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠心力衰竭模型的建立

取雄性 ICR小鼠 80 只，適應性飼養(yǎng) 1 周后，其中70只行主動脈弓狹窄手術：手術方法參照deAlmeida 的方法[8]，手術結束將動物放入保溫箱保暖護理待其蘇醒；另10只小鼠行假手術，其它步驟相同但不縮窄主動脈弓，作為假手術組(Sham Group，NS，10 mL/kg，n=10)。

1.3.2 模型篩選與分組給藥

術后4周取存活動物進行心動超聲檢查，假手術組小鼠主動脈弓血流速度在 600 ～900 mm/s 之間，與假手術組小鼠相比，TAC手術成功的小鼠主動脈弓縮窄處血流速度急劇升高，達假手術組的2倍以上，以此為判斷標準，篩選出手術成功的小鼠，并根據EF檢測結果，指標相對接近的44只CHF小鼠模型用于試驗。超聲系統(tǒng)測算的左心室質量(LV mass)為主要指標，兼顧射血分數(EF)和體重將模型小鼠分為4組，即模型對照組(model group，NS，10 mL/kg，n=14)、冠心寧低劑量組(GXNT-L group，600 mg/kg，n=10)、冠心寧高劑量組(GXNT-H group，1200 mg/kg，n=10)、陽性對照組(CPT group，12.5 mg/kg，n=10)，連續(xù)給藥9周。

1.3.3 一般狀態(tài)觀察

試驗期間，觀察小鼠的精神狀態(tài)、糞便情況以及皮毛色澤和狀態(tài)，計算存活率。

1.3.4 心動超聲檢測

給藥3，6，9周時，采用異氟烷氣體麻醉，進行超聲心動檢測。具體方法：將小鼠進行異氟烷吸入麻醉，隨后使用高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)，測量射血分數(EF)，在2～3個心動周期上測量各指標并取其平均值。

1.3.5 Tunel 法檢測心肌細胞凋亡水平

取假手術組、模型對照組和GXNT-H組小鼠心肌組織石蠟切片脫蠟至水，經修復后，將末端脫氧核苷酸轉移酶、脫氧尿苷三磷酸按 2∶29 比例混合，覆蓋組織。切片平放于濕盒內，37℃ 孵育2 h后加入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育15 min。在 POD液中，37℃孵育30 min。洗滌，DAPI染色封片，其中細胞核呈綠色熒光為陽性，藍色熒光細胞核為陰性。每張切片選取 5 個視野(× 400)，使用Image-Pro Plus軟件計算陽性細胞數，根據心肌細胞凋亡指數(MCAI)=陽性細胞數 /總細胞數 × 100%，計算每個視野內的MCAI并取平均值。

1.3.6 熒光定量PCR檢測BAX和BCL2基因mRNA的表達

使用總RNA提取試劑盒(上海寶生物公司)提取假手術組、模型對照組和GXNT-H組小鼠心臟組織RNA，反轉錄成cDNA后待用，NCBI網站上查找GAPDH、BAX和BCL2序列，設計各引物序列如下：GAPDH：F-ATGCTGGTGCCGAGTATGTTGTG，R-GC AGAAGGTGCGGAGATGATGAC；BAX：F- GAGCGGC TGCTTGTCTGGATC，R-TGGTGAGTGAGGCAGTGAG GAC；BCL2：F- CTTCGCAGAGATGTCCAGTCAGC，R- AGAGTTCCTCCACCACCGTAGC。將cDNA用RT-PCR儀進行二步法擴增，所有反應信息資料由Bio-Rad iQ5 PCR儀收集。反應體系為20 μL，包括2 μL cDNA 溶液，10 μL SYBR?，每種引物1 μL(10 μmol/L)以及6 μL水。擴增條件：① 95℃預變性10 min，② 95℃變性15 s，③ 60℃退火1 min，②③循環(huán)40次。GADPH管家基因作為內參對照，目的基因轉錄水平通過公式2-△△CT計算。

1.3.7 全自動蛋白定量分析PI3K/AKT/BAX相關信號通路蛋白的表達

取50 mg心臟組織，使用總蛋白提取試劑盒(KeyGen Biotech，China)提取蛋白質。蛋白質表達水平在Wes儀器上使用Size Separation Master Kit with Split Buffer(12～230×103)檢測。 通過ProteinSimple軟件(版本2.7.1)進行可視化分析，并計算陽性蛋白質帶區(qū)域。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況和生存率

假手術組小鼠精神狀態(tài)良好，毛色順滑，從給藥開始至給藥9周結束，均未出現死亡；模型對照組14只小鼠，精神委頓，毛色粗亂，至給藥結束共死亡7只，生存率為50%，各給藥組小鼠精神狀態(tài)和毛色均有所改善，冠心寧片低劑量組共10只小鼠，死亡4只，存活率60%(P>0.05)，冠心寧片高劑量組共10只小鼠，死亡3只，存活率70%(P<0.05)，陽性對照組共10只小鼠，死亡4只，存活率60%(P>0.05)。見圖1。

2.2 小鼠心臟功能的改變

給藥3、6、9周時，進行心動超聲檢查，模型對照組小鼠EF均顯著下降(P<0.01)，給藥3周時，陽性對照組EF顯著上升(P<0.05)；給藥6周時，冠心寧高劑量組和陽性對照組EF顯著上升(P<0.05，P<0.01)；給藥9周時，冠心寧高、低劑量組和陽性對照組EF均顯著上升(P<0.05，P<0.01)。見圖2。由給藥9周時的M型超聲圖可見，假手術組小鼠心臟心室壁收縮幅度大，而模型對照組心室壁收縮幅度變小，生理曲度改變，GXNT-H組和陽性對照組均顯著改善，見圖3。

圖1 各組小鼠生存率Figure 1 Survival rate of mice in each group

注：與假手術組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 各組小鼠EF的變化Note. Compared with the sham group, #P<0.05，##P<0.01. Compared with the model control group, *P<0.05，**P<0.01.Figure 2 Changes of the ejection fraction in various groups of mice

注：A：假手術組，B：模型對照組，C：冠心寧片高劑量組，D：陽性對照組。圖3 各組小鼠心動超聲M型圖的變化Note. A, Sham Group. B, Model control Group. C, GXNT high dose group. D, Positive control group.Figure 3 Changes of cardiac M-type ultrasonogram in the mice of each group

2.3 小鼠心肌細胞凋亡水平

假手術組小鼠心肌組織經TUNEL染色后，可見少量細胞核被染上綠色熒光，而模型對照組小鼠心肌組織有大量細胞核被染成陽性，而冠心寧片高劑量組心肌陽性染色的細胞較少，統(tǒng)計分析后可見，與假手術組比較，模型對照心肌細胞凋亡系數顯著升高(P<0.01)，與模型對照組比較，冠心寧片高劑量組凋亡系數顯著降低(P<0.05)。見圖4A，4B。

2.4 小鼠心肌組織中細胞凋亡相關基因mRNA的表達

與假手術組比較，模型對照組小鼠心肌組織中BAX基因mRNA相對表達量顯著升高(P<0.01)，BCL2基因mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，而GXNT-H組BAX基因的mRNA相對表達量顯著下降(P<0.01)，BCL2表達無顯著差異。

2.5 小鼠心肌組織PI3K/AKT/BAX相關信號通路蛋白的表達

與假手術組比，模型對照組小鼠心肌組織PI3K、p-AKT/AKT、BAX蛋白表達水平上升，BCL2表達水平下降(P<0.05,P<0.01)；與模型對照組比，GXNT-H組小鼠心肌組織中PI3K、p-AKT/AKT、BAX表達水平下降(P<0.05,P<0.01)，BCL2表達變化不明顯(P>0.05)。見圖6。

注：與假手術組比較， ##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，。圖4 小鼠心肌組織中細胞凋亡比例Note. Compared with the sham group, ##P<0.01. Compared with the model control group, *P<0.05.Figure 4 Apoptosis ratio in the cardiomyocytes of mice

注：A：各組小鼠心肌組織BAX mRNA的表達，B：各組小鼠心肌組織BCL2 mRNA的表達。與假手術組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 各組小鼠心肌組織BAX和BCL2 mRNA的差異表達Note. A, Expression of BAX mRNA. B, Expression of BCL2 mRNA. Compared with the sham group, #P<0.05，##P<0.01. Compared with the model control group, *P<0.05，**P<0.01.Figure 5 Differential expression of BAX and BCL2 mRNA in the mouse myocardical tissues of each group

注：A：各組小鼠心肌組織PI3K的表達，B：各組小鼠心肌組織AKT磷酸化水平；C：各組小鼠心肌組織BAX的表達，D：各組小鼠心肌組織BCL2的表達。與假手術組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 小鼠心肌組織PI3K/AKT/BAX通路相關蛋白的改變Note. A, Expression of PI3K. B, AKT phosphorylation level. C, Expression of BAX. D, Expression of BCL2. Compared with the sham group, #P<0.05，##P<0.01. Compared with the model control group, *P<0.05，**P<0.01.Figure 6 Changes of PI3K/AKT/BAX pathway related proteins in myocardial tissue of the mice in eaeh group

3 討論

CHF是各種心臟疾病致心功能不全的臨床綜合征，也是大多數心血管疾病的最終歸宿。在臨床上，心衰無法治愈，年病死率高達40%，5年存活率甚至低于多種癌癥[9]。本實驗研究發(fā)現，給與高劑量冠心寧片能提高CHF模型小鼠的存活率，提示冠心寧片對CHF有改善作用。

超聲心動圖是臨床上常用的無創(chuàng)傷的檢測方法，利用M型超聲檢測可動態(tài)觀察心臟功能的改變，EF反應了心臟的收縮功能和泵血功能。本研究發(fā)現，模型對照組小鼠EF值持續(xù)下降，給與冠心寧片后，能有效提高EF值，尤其在給藥6～9周時，作用明顯，說明冠心寧片能提高心功能，給藥時間延長能提高其作用強度。

心肌細胞對缺血、缺氧非常敏感，在缺血或缺氧的情況下，炎性因子增多、脂質過氧化水平增加、細胞膜的穩(wěn)定性及完整性被破壞，導致心肌細胞凋亡[10-12]。本研究通過 TUNEL 染色觀察了心肌細胞凋亡情況，發(fā)現模型對照組小鼠心肌組織中凋亡細胞比例多于假手術組，而冠心寧片高劑量組凋亡細胞減少，可見冠心寧片能有效抑制心肌損傷造成的心肌細胞凋亡。BCL2 蛋白家族在細胞凋亡中起到重要的作用，BAX表達升高說明組織其中細胞凋亡水平升高，而BCL2表達升高，則對細胞凋亡有抑制作用[13]。研究發(fā)現，模型對照組小鼠心肌組織中BAX基因mRNA表達升高，BCL2基因表達下調，給與冠心寧片后，BAX基因表達下降，BCL2基因表達有升高趨勢，進一步證實了冠心寧片具有降低心肌細胞凋亡的作用。

BCL2/BAX受PI3K/AKT信號通路調控，且多種體內體外研究表明PI3K信號通路與CHF的發(fā)展相關[14]。PI3K的主要結構由兩部分組成，即調節(jié)亞基P85和催化亞基 P110。當接收刺激信號時，P85調節(jié)PI3K使募集到質膜附近，P110與P85結合，將底物磷脂酰肌醇2磷酸轉化為磷脂酰肌醇3磷酸；磷脂酰肌醇3磷酸與AKT結合，使AKT從細胞質轉移到細胞膜上，激活 AKT[15]。過度活化的AKT可抑制心肌細胞增殖，誘導BAX基因表達，促進心肌細胞凋亡，促進 HF的發(fā)生和發(fā)展[16]。 在本研究中，從蛋白表達水平上看，模型對照組小鼠心肌組織PI3K、p-AKT/AKT、BAX表達水平上升，BCL2表達水平下降，給與冠心寧后，PI3K表達水平和AKT磷酸化水平顯著下降，提示冠心寧片是通過抑制PI3K/AKT/BAX信號通路的活化減少心肌細胞的凋亡，從而改善CHF小鼠的心臟功能。

綜上所述，冠心寧片能提高CHF小鼠的存活率，增強高CHF小鼠的心臟功能，其作用機制可能是通過抑制PI3K/AKT/BAX信號通路的活化減少心肌細胞的凋亡，從而改善CHF小鼠的心衰癥狀。