恩拉霉素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

韓寧寧 楊秀玉 戴青 趙暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

恩拉霉素屬多肽類抗生素，結(jié)構(gòu)見圖1，最初在1966年，日本武田藥品工業(yè)株式會社研究人員，從日本兵庫縣西宮市的土壤中分離出來的一株殺真菌鏈霉菌Streptomyces fungicidiousNo.B-5477產(chǎn)生的發(fā)酵代謝產(chǎn)物[1]。其具有優(yōu)良的促生長[2]和改善飼料利用率的作用，且具有高穩(wěn)定性、低毒性、低藥物殘留、不易耐藥等特點(diǎn)，其作為飼料添加劑具有較大的市場需求。

恩拉霉素預(yù)混劑于20世紀(jì)90年代由日本武田藥業(yè)株式會社對我國進(jìn)口獸藥注冊，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(1999年版)[3]。2000年，Schering Plough公司收購了日本武田動物保健公司，該產(chǎn)品由Schering plough公司獨(dú)家生產(chǎn)經(jīng)營。2005年，國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)浙江海正藥業(yè)股份有限公司與Schering plough動物保健品有限公司合作，生產(chǎn)恩拉霉素預(yù)混劑[4]，并于2015年取得國產(chǎn)新獸藥注冊證書，其標(biāo)準(zhǔn)收載于農(nóng)業(yè)部公告2271號[5]。

圖1 恩拉霉素結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of enramycin

雖然目前恩拉霉素預(yù)混劑已有法定公告標(biāo)準(zhǔn)，但原料一直沒有相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，目前日本藥局方、美國藥典及歐洲藥典中均未收載恩拉霉素原料藥及相關(guān)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，各恩拉霉素預(yù)混劑的生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品含量均溯源至日本農(nóng)林水產(chǎn)消費(fèi)安全技術(shù)委員會的標(biāo)準(zhǔn)品。因此，建立恩拉霉素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對于恩拉霉素原料及預(yù)混劑的生產(chǎn)及質(zhì)量控制具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CHB-1型抗生素效價測量儀(北京潮聲技術(shù)開發(fā)公司)；高效液相色譜儀(HPLC)(Waters e2695色譜系統(tǒng)，Empower 3色譜工作站)；二極管陣列檢測器(PDA)(Waters 2998)；XS205分析天平(Mettler toledo)。

1.2 菌株、樣品、培養(yǎng)基與試劑

枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501(中國食品藥品檢定研究院)。恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品(來源/批號/含量：日本農(nóng)林水產(chǎn)消費(fèi)安全技術(shù)委員會/L004993317-000A003/1146u/mg?？股貦z定Ⅰ號培養(yǎng)基、乳酸緩沖液(pH4.0)、生理鹽水及滅菌水均由北京中海生物科技有限公司配制。乙腈(MERCK公司色譜純試劑)。其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 HPLC-PDA法建立鑒別及恩拉霉素組分檢查方法

2.1.1 方法的建立過程

(1)液相色譜條件的建立：文獻(xiàn)方法[6]為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈(65:35,V/V)，檢測波長為267nm。嘗試該方法后發(fā)現(xiàn)，空白峰對恩拉霉素峰測定有干擾。通過調(diào)節(jié)流動相比例，最終確定為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈(73:27,V/V)，可排除空白峰對組分測定的干擾。通過掃描PDA光譜圖發(fā)現(xiàn)，恩拉霉素組分A與B最大吸收波長均在267nm附近，故仍采用該波長作為檢測波長。

(2)供試品溶液及對照品溶液的選擇：為簡化試驗(yàn)操作，選擇含量測定項(xiàng)下中間濃度的200u/mL的供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 鑒別及恩拉霉素組分檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

(1)鑒別質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：在恩拉霉素組分項(xiàng)下記錄的光譜圖中，供試品溶液恩拉霉素A和恩拉霉素B兩主峰的最大和最小吸收波長應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品溶液一致。

在恩拉霉素組分項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液恩拉霉素A和恩拉霉素B兩主峰的保留時間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品溶液一致。

(2)恩拉霉素組分檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：色譜條件：采用Alltima C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)，或同等柱效色譜柱；以0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈(73:27,V/V)為流動相；柱溫30℃；檢測波長267nm。精密量取含量測定項(xiàng)下的200u/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL注入液相色譜儀，采集色譜圖，恩拉霉素組分A與組分B與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定，組分A的理論塔板數(shù)應(yīng)不小于2000。

測定法：精密量取含量測定項(xiàng)下的200u/mL的供試品溶液20μL注入液相色譜儀，采集色譜圖，恩拉霉素組分A占組分A與組分B的峰面積和的百分比應(yīng)不小于60.0%。

2.1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

(1)專屬性：依據(jù)上述方法，采集溶劑空白、供試品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖，考察溶劑空白是否對組分A或B峰有干擾，組分A或B與相鄰雜峰是否分離良好。

(2)檢測限：將約含200u/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液用乳酸緩沖液(pH4.0)進(jìn)一步稀釋，采集色譜圖，至組分A與B信噪比分別約為3，求得方法檢測限濃度。

(3)線性與范圍：取含量測定項(xiàng)下約含1000u/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用乳酸緩沖液(pH4.0)進(jìn)一步稀釋為100、200、250、300和350u/mL的溶液，分別采集色譜圖。將濃度與組分A與B峰面積和進(jìn)行線性回歸，考察二者線性關(guān)系。

(4)溶液穩(wěn)定性：將約含200u/mL的恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液室溫放置0、5、10、15、20和25h，分別采集色譜圖，觀察組分A與B峰面積變化，考察溶液穩(wěn)定性。

(5)耐用性：采用不同柱溫與流速、不同品牌色譜柱進(jìn)行測定，考察方法耐用性。

(6)組分限度的制定：收集2個原料藥廠家共10個批次恩拉霉素原料，按照上述方法測定恩拉霉素組分，制定相應(yīng)組分限度。

2.2 效價法建立恩拉霉素含量測定方法

2.2.1 方法的建立過程

(1)溶劑的選擇：《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》1999年版和2271號公告這2個預(yù)混劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，約含1000u/mL的溶液溶劑均為丙酮-1mol/L鹽酸溶液-水(35:12:56,V/V/V)(pH3.0)。進(jìn)一步稀釋所用溶劑分別為pH4.0的醋酸緩沖液和乳酸緩沖液。第一步溶劑擬與上述兩個標(biāo)準(zhǔn)保持一致，并對進(jìn)一步稀釋所用的緩沖液進(jìn)行選擇和優(yōu)化。嘗試了4種不同的緩沖液：pH4.0醋酸鹽緩沖液、pH4.0乳酸鹽緩沖液、pH6.0磷酸鹽緩沖液、pH7.8磷酸鹽緩沖液，考察樣品溶解情況及對枯草芽孢桿菌有無抑菌作用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pH4.0醋酸鹽緩沖液具有較強(qiáng)抑菌作用，不適宜作為稀釋用緩沖液；常用pH6.0及pH7.8的磷酸鹽緩沖液對恩拉霉素溶解性差，會導(dǎo)致樣品析出，亦不適宜。因此最終選用pH4.0的乳酸鹽緩沖液作為稀釋用緩沖液。

(2)培養(yǎng)基的選擇：《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(1999年版)采用培養(yǎng)基為抗生素I號(pH7.8)；2271號公告采用培養(yǎng)基為非藥典配方培養(yǎng)基，配方為：胨5.0g，牛肉膏5.0g，氯化鈉30.0g，磷酸氫二鈉2.0g，瓊脂13～15g，水1000mL，滅菌后pH值為(8.0±0.1)。采用已篩選固定的溶劑配制10～40u/mL的恩拉霉素溶液，分別加樣于上述兩種培養(yǎng)基中，觀察枯草芽孢桿菌生長情況及抑菌圈直徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌種CMCC(B)63501在2271號公告培養(yǎng)基上菌層稀薄，使用原液2%的菌懸液濃度，20u/mL的恩拉霉素溶液抑菌圈直徑在20mm左右，超過中國獸藥典[7]規(guī)定的15～18mm的范圍。而在抗生素I號培養(yǎng)基上，使用稀釋液0.3%的菌懸液濃度，即可使20u/mL的抗生素溶液抑菌圈直徑在15～18mm范圍內(nèi)。因此最終采用抗生素I號培養(yǎng)基。

2.2.2 含量測定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

取本品適量，精密稱定，用丙酮-1mol/L鹽酸溶液-水(35:12:56,V/V/V)[用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至(3.0±0.2)]溶解并稀釋制成約含1000u/mL的溶液。用乳酸緩沖液(pH4.0)稀釋制成約含200u/mL的溶液，再用上述緩沖液稀釋制成約含10～40u/mL的溶液。另取恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，同法配制。照抗生素微生物檢定法(《中國獸藥典》2015年版一部附錄1201)測定。

試驗(yàn)菌：枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501或CVCC717]。培養(yǎng)基：抗生素I號，乳酸緩沖液(pH4.0)：取乳酸9.01g，加水750mL使溶解，加1mol/L氫氧化鈉溶液50mL，再加水稀釋至1000mL，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為(4.0±0.1)。

2.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

(1)專屬性：依據(jù)上述方法配制空白溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用稀釋液0.3%的菌懸液濃度測定，觀察空白溶液是否有抑菌作用，標(biāo)準(zhǔn)品中濃度溶液抑菌圈直徑是否在藥典規(guī)定的15～18mm范圍內(nèi)。

(2)線性和范圍：取標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，用丙酮-1mol/L鹽酸溶液-水(35:12:56,V/V/V)[用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至(3.0±0.2)]溶解并稀釋為1000u/mL的溶液。用乳酸緩沖液(pH4.0)將上述溶液稀釋為8.2、10.25、12.8、16、20、25、31.25、39.0625和48.8u/mL的溶液。配制24個菌碟，分為8組，每組3個菌碟。每個菌碟6個鋼管，其中標(biāo)準(zhǔn)品的3個位置滴加25u/mL的中間濃度溶液，供試品的3個位置每組分別滴加剩余8個濃度的溶液。測定抑菌圈直徑。將抗生素濃度的對數(shù)值和每組直徑平均值與25u/mL的直徑平均值之差進(jìn)行線性回歸，考察二者線性關(guān)系。

(3)精密度：兩個檢驗(yàn)員，各平行配制5份100%濃度水平的供試品溶液，采用上述方法進(jìn)行測定，考察方法精密度。

(4)準(zhǔn)確性：將另一批恩拉霉素原料進(jìn)行含量測定后，取約12.5mg，精密稱定，加入已標(biāo)定過的12.5mg的原料中，作為回收率測定供試品。平行制備6份上述回收率供試品，照上述方法進(jìn)行添加回收率測定，考察方法準(zhǔn)確性。

3 結(jié)果及分析

3.1 鑒別及恩拉霉素組分檢查方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

3.1.1 專屬性

溶劑空白對恩拉霉素組分測定無干擾，組分A與B與相鄰雜峰分離度符合要求，參見圖2～4。

3.1.2 檢測限

圖2 鑒別及組分檢查溶劑空白光譜指數(shù)圖Fig.2 Chromatogram of solvent in the enramycin identification and components examiation

圖3 鑒別及組分檢查標(biāo)準(zhǔn)品溶液光譜指數(shù)圖Fig.3 Chromatogram of the standard solution in the enramycin identification and components examiation

10u/mL的溶液組分B信噪比為8.6，2u/mL的溶液組分A的信噪比為7.4。故組分A的檢測限為2u/mL，組分B的檢測限為10u/mL。

3.1.3 線性與范圍

濃度與組分A與組分B峰面積之和的線性方程為y=11.504x+1.0875，r=0.9999。結(jié)果表明在100～350u/mL范圍內(nèi)濃度與組分A與組分B峰面積之和具有良好的線性關(guān)系。

3.1.4 溶液穩(wěn)定性

如表1所示，該溶液室溫放置25h穩(wěn)定性良好。

3.1.5 耐用性

表2所示，不同柱溫與流速耐用性良好。更換色譜柱品牌后，組分A與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均不符合要求，表明該方法對色譜柱柱效有較高要求。另外，在色譜條件選擇時即發(fā)現(xiàn)，流動相比例為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈(65:35,V/V)或(70:30,V/V)時組分A或組分B與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均欠佳；比例為(73:27,V/V)時組分A或組分B與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均符合要求；比例為(75:25,V/V)時組分A 47min洗脫，組分B 60min內(nèi)不洗脫，分析時間過長。故應(yīng)控制流動相比例為(73:27,V/V)。在耐用性試驗(yàn)中未對流動相比例進(jìn)行進(jìn)一步考察。

表1 鑒別及組分檢查溶液穩(wěn)定性結(jié)果Tab.1 Results of the solution stability in the enramycin identification and components examiation

表2 鑒別及組分檢查耐用性結(jié)果Tab.2 Results of durability in the enramycin identification and components examiation

3.1.6 組分限度的制定

采用上述方法測定2個廠家共10批恩拉霉素原料組分，結(jié)果如表3所示。根據(jù)該表結(jié)果，制定恩拉霉素組分限度為：恩拉霉素組分A占組分A與組分B的峰面積和的百分比應(yīng)不小于60.0%。

3.2 效價含量測定方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

3.2.1 專屬性

表3 不同批次恩拉霉素原料藥組分測定結(jié)果Tab.3 Results of components examiation of 10 batches of enramycin

空白溶液無抑菌圈，標(biāo)準(zhǔn)品中濃度溶液抑菌圈直徑在15～18mm范圍內(nèi)，菌圈邊緣清晰圓整。

3.2.2 線性和范圍

恩拉霉素濃度的對數(shù)與抑菌圈直徑和25u/mL抑菌圈直徑之差的線性方程為y=0.181x+1.3987，r=0.9995。表明在濃度10～48u/mL的范圍內(nèi)恩拉霉素濃度的對數(shù)與抑菌圈直徑線性關(guān)系良好。

3.2.3 精密度

結(jié)果如表4所示，中間精密度結(jié)果良好。

3.2.4 準(zhǔn)確性

結(jié)果如表5。平均回收率96.3%，RSD為2.9%，準(zhǔn)確性結(jié)果良好。

4 討論

4.1 性狀及殘留溶劑項(xiàng)未收錄至質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的原因

經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)，恩拉霉素原料一般有兩種形式：單體形式和鹽酸鹽形式。單體形式為灰褐色至褐色粉末，鹽酸鹽形式為白色粉末。兩種形式的原料溶解性亦有較大差異。由于無法限定恩拉霉素原料是否必須成鹽，故未將性狀項(xiàng)收錄進(jìn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

表4 含量測定精密度結(jié)果Tab.4 Results of precision in the content determination

表5 含量測定回收率測定結(jié)果(%)Tab.5 Results of recovery rate in the content determination(%)

經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)，收集到的兩家企業(yè)的恩拉霉素原料制備過程中用到的主要有機(jī)溶劑為丙酮，亦建立了丙酮的氣相測定方法。但考慮到不同廠家原料生產(chǎn)過程中所用溶劑可能存在較大差異，故未將殘留溶劑項(xiàng)收錄進(jìn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

4.2 除上述質(zhì)量控制項(xiàng)目外，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中收錄的其他檢查項(xiàng)目

除上述質(zhì)量控制項(xiàng)目外，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中亦收錄了干燥失重檢查項(xiàng)。兩個預(yù)混劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對水分的控制均采用干燥失重的方法，其中《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(1999年版)采用60℃減壓干燥至恒重，減失重量不得過6.0%；2271號公告采用105℃干燥至恒重，減失重量不得過10.0%?？紤]到恩拉霉素結(jié)構(gòu)中不包含結(jié)晶水，不存在干燥失重?zé)o法除去結(jié)晶水的問題，且其在丙酮、甲醇等常見水分測定溶劑中溶解度均較差，故不考慮費(fèi)休氏法測定水分，僅對60℃減壓及105℃兩種干燥失重條件進(jìn)行比較。結(jié)果表明，同一批原料60℃減壓及105℃ 3h后，二者均可達(dá)到恒重，前者失重5.36%，后者失重5.82%。推測由于105℃條件更為劇烈從而更易除去高沸點(diǎn)溶劑。采用105℃干燥至恒重法對收集到的10批恩拉霉素原料進(jìn)行測定，干燥失重均小于6.0%。因此在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：取本品，在105℃干燥至恒重，減失重量不得過6.0%。