利用流式細(xì)胞儀鑒定槭樹染色體倍性的方法探究

柳 斌，任紅劍，李美榮，賈冰玉，黃 華

（1.寧陽(yáng)縣生態(tài)林業(yè)發(fā)展中心，山東 泰安 271400；2.寧陽(yáng)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 泰安 271400；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東 泰安 271000）

多倍體植物通常表現(xiàn)有莖干粗壯、葉片大而厚和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，特別是在生長(zhǎng)速度、遺傳特性等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[1]。植物多倍化進(jìn)程當(dāng)中，基因表達(dá)傳控出現(xiàn)巨大變化[2]，這為植物變異進(jìn)化提供了有利條件，植物多倍體誘導(dǎo)是今后植物遺傳變異研究的重要育種手段。

流式細(xì)胞儀可以定量測(cè)試某一植物細(xì)胞中RNA、DNA的含量，與傳統(tǒng)的組型分析法染色體計(jì)數(shù)法相比，該方法能夠較為迅速準(zhǔn)確地鑒定植物倍性[3]。在植物遺傳育種研究過(guò)程中，流式細(xì)胞儀的檢測(cè)不受植物取材部位與時(shí)間限制，極為方便簡(jiǎn)單，精準(zhǔn)度較高[4]。某一植物多倍體一旦產(chǎn)生后能夠增加該類群植物的遺傳進(jìn)化多樣性，為培育植物新品種和育種研究提供重要參考。

三角楓（Acer buergerianum Miq.）和元寶楓（Acer truncatum Bunge）都屬槭樹科槭樹屬落葉喬木，都是我國(guó)自然分布廣泛的優(yōu)良鄉(xiāng)土觀賞樹種[5]。有關(guān)槭樹類植物多倍體的報(bào)道較少，僅有山東農(nóng)業(yè)大學(xué)豐震教授的研究團(tuán)隊(duì)，對(duì)以三角楓為代表的槭樹植物進(jìn)行過(guò)多倍體誘導(dǎo)試驗(yàn)[6]，并獲得三角楓多倍體的植物新品種，命名為“興旺”。

本試驗(yàn)研究利用流式細(xì)胞儀，以元寶楓、三角楓等槭樹植物葉片為試驗(yàn)材料，探究快速鑒定槭樹科植物倍性的步驟和方法。該試驗(yàn)探究為開(kāi)展槭樹科植物多倍體育種奠定基礎(chǔ)，以期為槭樹科植物多倍體育種工作能夠取得突破性進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試三角楓材料：三角楓1號(hào)和三角楓2號(hào)，均取自山東省高橋國(guó)有林場(chǎng)苗圃基地內(nèi)的槭屬資源圃。兩個(gè)三角楓無(wú)性系的選育方法：在槭屬資源圃內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩株生長(zhǎng)特征比較奇特的單株，之后用普通三角楓實(shí)生苗作砧木，通過(guò)嫁接方式培育得到三角楓1號(hào)和2號(hào)。

供試元寶楓材料：元寶楓A號(hào)、元寶楓F號(hào)，取自山東勝鑫園林苗圃地內(nèi)。兩個(gè)元寶楓無(wú)性系的選育方法：通過(guò)多年野外調(diào)查和選擇，確定了一株秋葉紅色明顯且時(shí)間較長(zhǎng)的優(yōu)良母株，從其母株上采種、播種繁殖形成 A、B、C、D、E、F、G 號(hào) 7 個(gè)家系，而本試驗(yàn)中所采用的元寶楓A號(hào)是從A號(hào)家系單株嫁接繁殖得到的3年生無(wú)性系苗。元寶楓F號(hào)同樣是從F號(hào)家系單株經(jīng)過(guò)上述過(guò)程繁育而來(lái)。元寶楓A號(hào)和元寶楓F號(hào)是其中兩個(gè)形態(tài)及秋季葉色差異顯著的單株，其中，元寶楓A號(hào)秋季葉色表現(xiàn)為鮮紅色，葉柄較短，樹冠寬廣；元寶楓F號(hào)秋季葉色表現(xiàn)為金黃色，葉柄長(zhǎng)而纖細(xì)較柔軟，樹冠窄。嫁接所用的砧木是同批次得到的元寶楓實(shí)生苗，種子采自于山東省高橋國(guó)有林場(chǎng)10年生以上的元寶楓大樹。

葉片采自于2018年9月份，每個(gè)系號(hào)分別采集葉片。采集時(shí)，用酒精輕微擦洗后用錫箔紙包好后，立即放入液氮中帶至山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。從液氮中取出后迅速放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 槭樹外觀形態(tài)測(cè)定

使用游標(biāo)卡尺測(cè)量4個(gè)系號(hào)的槭樹葉片長(zhǎng)度、寬度和葉柄長(zhǎng)度，用測(cè)桿和圍尺分別測(cè)量其樹高和胸徑。

1.3 槭樹DNA含量的測(cè)定

1.3.1 溶液配備

溶液Ⅰ：將4.2 g濃度為0.1 mol/L的檸檬酸和1 ml的0.5%的吐溫20混合，將其定容至200 mL，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

溶液Ⅱ：將28.65 g濃度為0.4 mol/L的磷酸氫二鈉，PI 20 mg定容至200 mL，在室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 材料處理與檢測(cè)

分別取兩個(gè)三角楓和元寶楓的無(wú)性系各少量的葉片，放在4個(gè)不同的干凈培養(yǎng)皿內(nèi)并標(biāo)號(hào)1、2、3、4 號(hào)（1、2、3、4 號(hào)分別代表三角楓 1 號(hào)、三角楓 2號(hào)、元寶楓A、元寶楓F。要注意避開(kāi)葉脈的干擾）。用移液槍取 200μL溶液Ⅰ和600μL溶液Ⅱ分別加入4個(gè)培養(yǎng)皿，在此裂解液中用鋒利的雙面刀片切碎葉片。之后靜置10min左右，使其裂解。（一般嫩葉只需3-5min）

裂解之后的葉片溶液經(jīng)過(guò)尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，將所得濾液在13000 r/min的條件下離心30s，4個(gè)培養(yǎng)皿分別過(guò)濾到4個(gè)不同的Eppendorf管中，分別標(biāo)號(hào) 1、2、3、4 號(hào)。 之后加入 PI（染料）使染料和葉片溶液整個(gè)的溶液濃度大約維持在0.1mol/L左右。

4 個(gè)不同的 Eppendorf管中標(biāo)號(hào)的 1、2、3、4 號(hào)對(duì)應(yīng)是三角楓1、三角楓2、元寶楓A號(hào)、元寶楓F號(hào)，分別用1 mL移液槍取上滴0.1mL處的液體，加入流式細(xì)胞儀內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2007和SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析后，得到4個(gè)槭樹品系的圖像（圖1-圖4）如下：元寶楓的活細(xì)胞數(shù)所占比例是優(yōu)于三角楓的，具體活細(xì)胞所占比例的關(guān)系是：三角楓1號(hào)＜三角楓2號(hào)＜元寶楓A號(hào)＜元寶楓F號(hào)。而DNA含量方面三角楓高于元寶楓。尤其三角楓1號(hào)，DNA含量較高。由于采集葉片時(shí)間正處秋季，葉子的纖維素含量過(guò)高，雖然采集的是嫩梢基部的綠葉，但是總體效果不是太好，黑色雜質(zhì)部分較多（主要是由于季節(jié)的原因）。

圖1 三角楓1號(hào)檢測(cè)圖像

圖2 三角楓2號(hào)檢測(cè)圖像

圖3 元寶楓A號(hào)檢測(cè)圖像

圖4 元寶楓F號(hào)檢測(cè)圖像

2.2 形態(tài)特征比較

三角楓1號(hào)枝干高大挺拔，葉片肥厚寬大，當(dāng)年新生枝條鮮綠色；三角楓2號(hào)，樹冠分散，葉片、樹高等形態(tài)數(shù)據(jù)明顯小于三角楓1號(hào)；元寶楓A號(hào)和元寶楓F號(hào)形態(tài)數(shù)據(jù)較為相似，樹高有所差距，葉片表現(xiàn)形態(tài)基本一致，葉長(zhǎng)、葉寬在60 mm和90 mm左右。四個(gè)槭樹品系的葉片形態(tài)學(xué)比較結(jié)果如表1所示。兩個(gè)三角楓品系間差異顯著。

表1 形態(tài)特征比較

3 討論與結(jié)論

流式細(xì)胞儀能夠自動(dòng)快速地進(jìn)行植物的倍性檢測(cè)[7-8]，流式細(xì)胞儀進(jìn)行植物倍性鑒定的數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，多次得到試驗(yàn)證實(shí)。本文用流式細(xì)胞儀鑒定兩個(gè)三角楓品系和兩個(gè)元寶楓品系，通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，得到春季嫩葉的葉尖是最優(yōu)檢測(cè)時(shí)間和位置；最優(yōu)裂解液是0.1 mol/L的檸檬酸和0.5%的吐溫20制成的混合液取200ul，再加入0.4 mol/L的磷酸氫二鈉600ul。檢測(cè)得到的其活細(xì)胞數(shù)和DNA含量均差異差異較為顯著，具體活細(xì)胞所占比例的關(guān)系是：三角楓1號(hào)＜三角楓2號(hào)＜元寶楓A號(hào)＜元寶楓F號(hào)；DNA含量方面三角楓高于元寶楓。

多倍體個(gè)體在植物界中廣泛存在，這是植物趨于進(jìn)化變異、適應(yīng)新環(huán)境的重要途徑之一[9]。多倍體育種在林業(yè)植物新品種發(fā)展中具有巨大潛力，林木多倍體在長(zhǎng)勢(shì)和抗逆性方面均優(yōu)于普通種質(zhì)[10]。多倍體研究當(dāng)中，對(duì)形態(tài)學(xué)的比較分析是非常必要的[11]，本試驗(yàn)就是對(duì)各槭樹植物形態(tài)進(jìn)行測(cè)量比較的，得到結(jié)果，三角楓1號(hào)的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)明顯大于三角楓2號(hào)，其枝干高大挺拔，葉片肥厚寬大；元寶楓A號(hào)和元寶楓F號(hào)形態(tài)整體較為相似。

槭樹植物作為傳統(tǒng)的彩葉樹種[12-13]，社會(huì)需求量越來(lái)越大，其育種繁殖研究肯定會(huì)成為熱點(diǎn)。槭樹多倍體研究為槭樹植物新種質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)，會(huì)加速槭樹植物新品種的培育與繁殖?？傊?，流式細(xì)胞儀是快速便捷鑒定植物倍性的現(xiàn)代化科技手段，本試驗(yàn)通過(guò)用槭樹科植物對(duì)該類群進(jìn)行倍性檢測(cè)，是對(duì)該領(lǐng)域一個(gè)新的探索，同時(shí)也為槭樹科植物多倍體育種提供了一定的方向和目標(biāo)。