自發(fā)性糖尿病食蟹猴的診斷及其骨微結(jié)構(gòu)的改變

賈歡歡，羅曉玲，高洪彬，梁十，羅挺，陳結(jié)文，何積存，黃慶宇，李永鋒，盧麗*，陳梅麗*

(1. 廣東省實驗動物監(jiān)測所；廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663； 2. 廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州 510006； 3. 廣州春盛生物研究院有限公司，廣州 510940)

骨質(zhì)疏松是糖尿病常見的并發(fā)癥，有研究報道糖尿病患者骨密度下降且骨脆性增加，骨折風(fēng)險高于正常同齡人[1-3]。目前糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松(diabetic osteoporosis，DOP)的病因不明且無良好的治療藥物。有研究者認(rèn)為糖尿病作為一種內(nèi)分泌代謝失常的疾病，其體內(nèi)鈣、磷、鎂等電解質(zhì)代謝紊亂可能是導(dǎo)致患者骨結(jié)構(gòu)改變的重要原因[4]。

良好疾病動物模型的缺乏是制約DOP發(fā)病機理及治療方法研究的瓶頸，特別是與人類遺傳譜系更加接近的非人靈長類疾病動物模型?，F(xiàn)有DOP模型主要是通過藥物誘導(dǎo)或自發(fā)糖尿病動物加去卵巢方式構(gòu)建，主要為嚙齒類的大小鼠模型，這些模型造模方法與人類DOP的發(fā)病方式差異較大，且嚙齒類動物與人類遺傳譜系差異較大，并非良好的DOP疾病動物模型[5]。因此,建立非人靈長類DOP模型將對DOP的研究起到一定的推動作用。

徐傳磊等[6]研究發(fā)現(xiàn)食蟹猴正常空腹血糖為(5.10 ± 1.89)mmol/L，當(dāng)食蟹猴空腹血糖≥8.0 mmol/L且持續(xù)3周以上，或糖耐量實驗中葡萄糖負(fù)荷后120 min時血糖≥10.0 mmol/L時，只要滿足其一即可確診糖尿病。結(jié)合我們前期研究結(jié)果，綜合上述糖尿病食蟹猴確診條件，本研究將綜合分析正常食蟹猴與自發(fā)糖尿病食蟹猴骨結(jié)構(gòu)的差異，為DOP模型的建立提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

13 ～ 20歲普通級雌性自發(fā)糖尿病食蟹猴4只，同年齡段普通級雌性正常食蟹猴5只。由廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司提供【SCXK(粵)2014-0027】，飼養(yǎng)于廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司普通環(huán)境動物設(shè)施【SYXK(粵)2017-0176】。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20 ～ 26℃，相對濕度4%～70%，12 h/12 h 晝夜明暗交替，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼喂，自由飲食。

1.1.2 實驗試劑

總膽固醇(TCHO)測定試劑盒(廣州科方，CH2319)；低密度脂膽固醇(LDL-C)測定試劑盒(廣州科方，CH2519)；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒(廣州科方，CH2419)；甘油三酯(TG)測定試劑盒(廣州科方，TG2219)；肌酐(Crea)測定試劑盒(廣州科方，CR2919)；尿素氮(urea nitrogen, BUN)測定試劑盒(廣州科方，UR3119))；葡萄糖溶液(科倫藥業(yè)，189887)；血糖試紙(Roche，2103178)。

1.1.3 實驗儀器

快速血糖儀(Roche，愛爾蘭)；全自動生化分析儀(日立3100，日本)；Micro-CT掃描系統(tǒng)(日立Latheta LCT-200，日本)。

1.2 方法

1.2.1 分組

實驗分為2組，正常對照組(normal group，NG)，5只；自發(fā)糖尿病組(spontaneous diabetic group，SDG)，4只。

1.2.2 空腹血糖及糖耐量試驗

禁食超過12 h后，根據(jù)實驗動物體重，以4 mL/kg給動物鼻飼灌胃50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖溶液，并于0 min(灌胃前)、10、30、60、90、120 min針刺后肢靜脈采血，用快速血糖儀檢測血糖。

1.2.3 血液生化檢測

禁食超過12 h后，肌肉注射15 mg/kg 氯胺酮對食蟹猴進行麻醉后后肢靜脈采血。全血在室溫下放置30 ～ 50 min，3000 r/min離心10 min，取血清，用自動生化分析儀檢測血液生化學(xué)指標(biāo)，包括總膽固醇(TC)、低密度脂膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、肌酐(Crea)和尿素氮(BUN)等。

1.2.4 骨骼的Micro-CT檢查

肌肉注射15 mg/kg 氯胺酮麻醉后放血處死動物，取其股骨及脛骨，放入4%甲醛溶液中固定48 h。運用Micro-CT成像系統(tǒng)對食蟹猴骨骼標(biāo)本進行掃描。Micro-CT掃描參數(shù)為電壓80 kV，電流：0.5 mA，層厚：80 μm，分辨率：80 μm，旋轉(zhuǎn)角度：360°。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動物空腹血糖及糖耐量

空腹血糖檢查發(fā)現(xiàn)，SDG組食蟹猴空腹血糖值高于NG組，差異有顯著性(P< 0.01)，且SDG組動物空腹血糖值大于8.0 mmol/L。糖耐量檢測發(fā)現(xiàn)，給予葡萄糖10 min后兩組血糖值均明顯升高，隨著時間的延長血糖值開始下降，給予葡萄糖120 min時NG組血糖值恢復(fù)正常水平，而SDG組血糖值仍高于10.0 mmol/L，兩組間比較差異有顯著性(P< 0.01)。(表1)

2.2 血液生化檢測

血液生化檢測發(fā)現(xiàn)，與NG組比較SDG組食蟹猴血清中TG及LDL-C水平升高，差異有顯著性(P< 0.01)；HDL-C及Crea水平下降，差異有顯著性(P< 0.05)。TC及BUN兩組間比較，差異無顯著性(P> 0.05)。(表2)

表1 空腹血糖及糖耐量結(jié)果Table 1 Results of fasting blood glucose and glucose tolerance ± s,mmol/L)

注：NG為正常對照組，SDG為自發(fā)糖尿病組。與NG組比較，*P< 0.05；**P< 0.01。(下同)

Note. NG: Normal group. SDG: spontaneous diabetic group. Compared with the normal group,*P< 0.05,**P< 0.01.(The same in the following table and figures)

表2 血液生化檢測結(jié)果Table 2 Results of blood biochemical ± s)

2.3 骨骼的Micro-CT檢查

2.3.1 骨結(jié)構(gòu)變化

運用VGStudio MAX 2.2進行3D建模發(fā)現(xiàn)，與NG組比較，SDG組動物股骨及脛骨骨小梁數(shù)量均明顯下降，NG組為大量針狀或片狀的骨小梁連接成多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而SDG組動物骨小梁間距增大，部分區(qū)域骨小梁消失，骨小梁厚度降低，股骨與脛骨區(qū)域的骨小梁出現(xiàn)穿孔。(圖1)

2.3.2 股骨下段及脛骨上段松質(zhì)骨變化

與NG組比較，SDG組動物股骨下段松質(zhì)骨骨小梁面積(Tb.Ar)、骨小梁體積(Tb.V)及骨小梁骨礦含量(BMC)均顯著下降，差異有顯著性(P< 0.05)；此外與NG組比較，SDG組動物脛骨上段松質(zhì)骨骨小梁面積(Tb.Ar)、骨小梁體積(Tb.V)及骨小梁骨礦含量(BMC)均顯著下降，差異有顯著性(P< 0.01)。(圖2)

2.3.3 股骨下段及脛骨上段皮質(zhì)骨變化

NG組與SDG組動物股骨下段及脛骨上段骨礦含量及皮質(zhì)骨厚度差異無顯著性(P> 0.05)。(圖3)

3 討論

圖1 自發(fā)性糖尿病食蟹猴和對照組動物骨骼三維重建圖Figure 1 Three-dimensional bone reconstruction of the normal group and spontaneous diabetic group

圖2 自發(fā)性糖尿病食蟹猴和對照組動物股骨和脛骨松質(zhì)骨骨小梁參數(shù)Figure 2 Trabecular parameters of cortical bone in the femur and tibia of normal and spontaneous diabetic groups

圖3 自發(fā)性糖尿病食蟹猴和對照組動物股骨和脛骨皮質(zhì)骨參數(shù)Figure 3 Cortical bone parameters in the femur and tibia of normal group and spontaneous diabetic group

糖尿病是一種以高血糖為特征的內(nèi)分泌代謝失常疾病，在機體糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝紊亂的同時，還能引起鈣質(zhì)及骨代謝的異常[7]。糖尿病表現(xiàn)為“三多一少”即多飲、多食、多尿及體重減少，患者體內(nèi)大量的鈣、鎂、磷等元素會隨著尿液的排出而大量流失，導(dǎo)致骨骼代謝受到影響，而體內(nèi)鈣的失衡同時會引起機體激素分泌異常，促進骨吸收功能，導(dǎo)致骨量下降和骨結(jié)構(gòu)的破壞，這些都可能是DOP發(fā)生的重要因素[8]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者在血脂代謝紊亂的同時也常伴隨著腎功能的異常[3]，而傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，腎主骨，腎的精氣盛衰，直接影響骨骼的生長和功能。有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者和骨質(zhì)疏松患者均出現(xiàn)血清總膽固醇、甘油三酯及低密度脂膽固醇顯著升高，高密度脂膽固醇、肌酐及尿素氮水平的下降[9-10]，因此血脂和腎功能生化指標(biāo)的檢測可作為糖尿病食蟹猴診斷的輔助指標(biāo)。

基于以上報道，對于糖尿病的診斷主要以空腹血糖與糖耐量試驗為主，而血清中血脂及腎功能生化指標(biāo)作為輔助診斷方法。目前對于食蟹猴糖尿病的診斷并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，我們采用徐傳磊等人的研究結(jié)果，食蟹猴空腹血糖≥8.0 mmol/L且持續(xù)3周以上，或糖耐量試驗中葡萄糖負(fù)荷后120 min時血糖≥10.0 mmol/L時，滿足其一即可確診糖尿病[6]。對骨質(zhì)疏松的診斷主要通過影像學(xué)方法，如微量CT或MRI分析骨骼的微結(jié)構(gòu)變化，包括松質(zhì)骨的骨小梁面積、骨小梁體積及骨礦含量等，皮質(zhì)骨的厚度及骨礦含量[11]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)自發(fā)糖尿病組食蟹猴空腹血糖值大于8.0 mmol/L，且糖耐量試驗中給予葡萄糖120 min時血糖值仍高于10.0 mmol/L，此外與對照組比較自發(fā)糖尿病食蟹猴血清中TG及LDL-C水平升高，HDL-C及Crea水平下降，通過以上結(jié)果可確診納入研究的疾病動物為自發(fā)糖尿病食蟹猴。Abdelrahman等[12]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的脛骨骨小梁微結(jié)構(gòu)明顯破壞，骨小梁數(shù)量顯著降低，而骨小梁間隙顯著增大。本研究中Micro-CT三維重建圖顯示自發(fā)糖尿病食蟹猴的股骨和脛骨的骨小梁數(shù)量減少，部分區(qū)域骨小梁出現(xiàn)穿孔，甚至出現(xiàn)骨小梁缺失。參數(shù)分析顯示股骨下段及脛骨上段的骨小梁面積，骨小梁體積及骨小梁骨礦含量等參數(shù)均顯著降低。以上結(jié)果表明，自發(fā)性糖尿病食蟹猴的松質(zhì)骨出現(xiàn)與糖尿病性骨質(zhì)疏松臨床病人相似的骨微結(jié)構(gòu)破壞。此外對皮質(zhì)骨的檢測發(fā)現(xiàn)，自發(fā)糖尿病食蟹猴與正常食蟹猴比較，股骨和脛骨皮質(zhì)骨厚度及骨礦含量無顯著性差異，但自發(fā)糖尿病動物有小幅升高，表明當(dāng)骨骼中松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)遭到破壞時皮質(zhì)骨呈現(xiàn)適應(yīng)性增厚，以支撐身體抵抗重力，這與生物力學(xué)的適應(yīng)性變化是相符的。

綜上所述，本研究中確診的自發(fā)糖尿病食蟹猴骨微結(jié)構(gòu)變差、骨量減少，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松樣變化，可作為一種自發(fā)的DOP食蟹猴模型，可為DOP發(fā)病機理及治療措施的研究提供研究基礎(chǔ)。