環(huán)剝對灰棗果實中糖積累及蔗糖代謝相關(guān)酶活性的影響

楊 磊，樊丁宇，靳 娟，徐葉挺，周曉明，馮貝貝，郝 慶

(新疆農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學觀測實驗站，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】環(huán)剝即環(huán)狀剝皮，是指將枝干的韌皮部剝?nèi)ヒ蝗?。環(huán)剝會暫時阻斷葉片合成的有機物向下運輸，導致碳水化合物在環(huán)剝口以上積累[1]，有助于提高坐果率[2]，增加產(chǎn)量[3]，改善果實品質(zhì)[4]等。加之，環(huán)剝具有投資小、見效快、操作簡單等優(yōu)點，作為果樹栽培管理中一項技術(shù)措施，在棗、蘋果、梨、葡萄、柑橘等多種果樹上已經(jīng)得到了廣泛應用[1]。隨著新疆特色林果業(yè)發(fā)展步伐的加快，棗樹以其耐干旱、耐貧瘠、耐鹽堿，抗逆性強，適應性廣，經(jīng)濟效益高，生態(tài)效益明顯[5]，近年在新疆迅速發(fā)展，截止2017年，新疆紅棗種植面積為47.6×104hm2，產(chǎn)量達347.0×104噸，面積和產(chǎn)量均居全疆林果之首[6]。紅棗已成為新疆林果業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)?；覘椬鳛槟辖貐^(qū)紅棗主栽品種之一，在增加農(nóng)民收入、改善生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮了重要作用。在南疆灰棗栽培管理中，環(huán)剝是提高坐果率、增加產(chǎn)量的一項重要技術(shù)措施?！厩叭搜芯窟M展】環(huán)剝有利于增大冬棗的果形指數(shù)[7]，提高冬棗坐果率、產(chǎn)量及果實的VC、總酸[8]，提高可溶性固形物含量和總糖含量[7-9]，也可提高棗果縱橫徑及單果質(zhì)量，促使果實膨大[8]。【本研究切入點】灰棗作為干鮮兼用良種，環(huán)剝是否會提高其果實的含糖量，以及環(huán)剝?nèi)绾斡绊懟覘椆麑嵵姓崽堑姆e累，目前還沒有開展相關(guān)的研究。研究環(huán)剝后棗果實發(fā)育過程中糖分含量的變化與蔗糖代謝相關(guān)酶活性之間的關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究對環(huán)剝灰棗果實發(fā)育過程中糖分組成、含量和影響果實發(fā)育過程中蔗糖代謝關(guān)鍵酶的活性進行研究，分析環(huán)剝與灰棗果實發(fā)育過程中蔗糖積累之間的關(guān)系，為改善灰棗果實品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2015年5月中旬，以葉城縣農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學觀測試驗站紅棗栽培試驗園內(nèi)5a生灰棗為材料，選擇生長發(fā)育良好、長勢、花期一致的20株為試驗樹，掛牌標記。

1.2 方 法

1.2.1 環(huán)剝處理

于6月12日灰棗盛花期進行環(huán)剝處理。主干環(huán)剝高度距離地面30 cm，環(huán)剝寬度為主干直徑的1/10。環(huán)剝后立即用5%辛硫磷500倍液對剝口及周圍進行涂抹，涂藥后用透明寬膠帶進行包裹，以預防灰暗斑螟的發(fā)生。10株主干環(huán)剝，10株不環(huán)剝作對照。

1.2.2 樣品采集

環(huán)剝后10 d開始采樣，每隔15 d采樣一次，至果實全紅后結(jié)束取樣。每次取樣分別從試驗樹的東、南、西、北四個方向選取大小一致的果實不少于30顆，蒸餾水清洗果面，所采的同一處理的樣品混合裝袋、標記，液氮保存。采樣結(jié)束后將液氮罐帶回烏魯木齊，樣品保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.2.3 糖提取和測定

取保存于超低溫冰箱內(nèi)的果實樣品，去除果皮和果核，稱取20個果的混合樣，液氮中研磨3～5 min，加提取液(乙醇∶氯仿∶水=12∶5∶3)再勻漿3～5 min，5 000 g離心15 min，取上清液，重復3次。合并提取液，轉(zhuǎn)入分液漏斗，加水使之分層，5 000 g離心10 min去除氯仿層，用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，在40℃真空中干燥，蒸餾水定容，用高效液相色譜測定糖的含量。色譜條件為：流動相(乙腈/重蒸水=70/30，v/v)流速1mL/min，碳水化合物柱，柱溫25℃，156示差檢測器，System Gold Software控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.2.4 酶提取

酶的提取在0～4℃條件下進行。稱取樣品，液氮中研磨5～10 min，加提取緩沖液(200 mmo/L磷酸鉀緩沖液，5 mmol/LMgCl2，0.1%β-巰基乙醇，0.05% Triton-X 100，0.05% BSA，2%PVPP，pH7.5)再勻漿3～5 min，20 000 g離心30 min，取上清液逐漸加(NH4)2SO4至80%飽和度，放置30 min，20 000 g離心20 min，去除上清液，加脫鹽緩沖液(20 mmol/L磷酸鉀緩沖液，0.25 mmol/L MgCl2，0.01%β-巰基乙醇，0.05% BSA，pH 7.5)重新溶解沉淀，按照Helmerhorst等的方法用Sephadex G-25柱離心脫鹽，脫鹽后的酶提取液用于酶活性分析。

SPS和SS的提取與轉(zhuǎn)化酶相似，只是提取緩沖液為200 mmol/L Hepes-NaOH (含5 mmol/LMgCl2，0.1%β-巰基乙醇，0.05% Triton-X 100，0.05% BSA，2% PVPP，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，10 mmol/L 抗壞血酸鈉，10 mmol/L半胱氨酸-鹽酸和2%甘油，pH 7.5)；脫鹽緩沖液為20 mmol/L Hepes-NaOH (含0.25 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，0.01%B-巰基乙醇，0.05% BSA，0.2%甘油，pH 7.5)。

1.2.5 酶活性測定

AI活性測定。在反應體系中含80 mmol/L醋酸-磷酸鉀(pH 4.5)，100 mmol/L蔗糖，酶提取液；37℃反應30 min，加入490 μL DNS試劑終止反應，沸水浴5 min，冷卻后測定A540。用殺死的酶液作對照。NI活性測定方法與AI類似，只是醋酸-磷酸鉀緩沖液的pH為7.5。

SPS活性測定。在70 μL反應體系中含50 mmol/L Hepes-NaOH緩沖液(pH7.5)，15 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L NaF，16 mmol/L UDP-Glucose，4 mmol/L Fru 6-P，20 mmol/L Glc 6-P，酶提取液；30℃反應30 min，加入70 μL 5mol/L NaOH終止反應，沸水浴10 min，冷卻后加入1 mL 0.14%的蒽酮(溶解在13.8 mol/L的H2SO4中)，40℃反應20 min，測定A620。對照反應體系中不含F(xiàn)ru 6-P和Glc 6-P。

SS合成方向的活性測定。在70 μL反應體系中含80 mmol/L Hepes-NaOH緩沖液(pH8.5)，5 mmol/L KCN，5 mmol/L NaF，100 mmol/L果糖，15 mmol/L UDP-Glucose，酶提取液；30℃反應30 min，加入70 μL 5 mol/L NaOH終止反應，沸水浴10 min，冷卻后加入1 mL 0.14%的蒽酮(溶解在13.8 mol/L的H2SO4中)， 40℃反應20 min，冷卻后測定A620。對照反應體系中不含果糖。

SS分解方向的活性測定。在490 μL反應體系中含80 mmol/L Mes緩沖液(pH 5.5)，5 mmol/L NaF，100 mmol/L蔗糖，5mmol/L UDP，酶提取液；30℃反應30 min，加入490 μL DNS試劑終止反應，沸水浴5 min，冷卻后測定A540。對照反應體系中不含UDP。

圖1 環(huán)剝下果實發(fā)育過程中果糖、葡萄糖、蔗糖含量變化
Fig.1 Effects of Girdling on the Contents of Fructose, Glucose and Sucrose during Fruit Development

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)剝對果實發(fā)育過程中蔗糖代謝相關(guān)糖分含量的影響

環(huán)剝處理和對照的灰棗果實在整個發(fā)育過程中，果糖、葡萄糖和蔗糖3種可溶性糖的含量變化基本一致，3種可溶性糖的積累隨著果實的發(fā)育總體呈上升趨勢。其中，果糖和葡萄糖含量在9月15日(果實全紅期)前呈逐漸升高的趨勢，進入果實全紅期后緩慢下降；蔗糖在7月30日(幼果膨大期)前未檢測到，7月30日至8月15日(果實白熟期)蔗糖緩慢積累，8月30日(果實轉(zhuǎn)紅期)后蔗糖快速積累，果實進入全紅期后蔗糖積累又趨于緩慢，至10月15日果實成熟，環(huán)剝和對照果實中蔗糖含量均超過163 mg/g，遠高于果糖和葡萄糖的含量，蔗糖和還原糖的比值為1.2∶1，灰棗果實以積累蔗糖為主。實驗過程中隨著果實的發(fā)育，環(huán)剝處理果實3種糖的含量總體高于同期對照果實的含量，說明環(huán)剝有利于灰棗果實果糖、葡萄糖和蔗糖的積累。圖1

2.2 環(huán)剝對果實發(fā)育過程中蔗糖代謝相關(guān)酶活性的影響

環(huán)剝和對照的果實在整個發(fā)育過程中酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)、中性轉(zhuǎn)化酶(NI)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)活性變化趨勢相似。其中，AI先快速上升，后緩慢降低；NI從幼果膨大期至果實成熟總體呈緩慢上升趨勢；SPS先緩慢上升，后快速下降；SS從幼果膨大期至8月30日(果實轉(zhuǎn)紅期)基本保持不變，9月15日(果實全紅期)迅速升高，之后快速下降。

果實中性轉(zhuǎn)化酶(NI)活性在8月15日(果實白熟期)之前對照略高于環(huán)剝處理，之后環(huán)剝果實NI活性開始逐漸上升并高于對照，至9月15日(果實全紅期)一直高于對照，之后環(huán)剝處理和對照均略有下降，并保持一致且平穩(wěn)水平。圖2

果實酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)活性在8月15日(果實白熟期)之前環(huán)剝處理和對照均快速上升，但環(huán)剝處理的AI活性明顯高于對照；之后二者又逐漸下降，其中環(huán)剝處理降幅大于對照，至9月15日(果實全紅期)對照的AI活性略有升高后繼續(xù)降低，至10月15日果實成熟二者達到相同水平。

環(huán)剝處理的灰棗果實SPS活性在7月15日(幼果膨大期)之前緩慢上升，7月30日明顯下降，之后至9月15日(果實全紅期)處于快速上升階段，9月15日之后又快速下降；對照果實SPS活性在8月15日(果實白熟期)之前均緩慢上升，之后至9月25日處于快速上升階段，9月25日之后快速下降；環(huán)剝處理和對照果實SPS活性在9月25日至10月15日果實全紅階段處于同等下降水平。

環(huán)剝和對照的果實在整個生長過程中SS合成方向(SSs)和SS分解方向(SSd)的活性變化基本一致。其中SSd活性一直處于緩慢下降的趨勢，但環(huán)剝SSd活性在7月30日(果實膨大期)之前高于對照，之后二者處于接近水平。SSs活性在8月30日(果實轉(zhuǎn)紅期)之前一直處于平穩(wěn)水平，之后快速上升，并在9月15日(果實全紅期)達到最大值后又快速下降，至9月25日下降趨勢開始明顯減緩，至10月15日果實成熟呈緩慢降低趨勢，但在9月15日(果實全紅期)至10月15日果實成熟，環(huán)剝處理果實的SSs活性顯著高于對照，這是環(huán)剝處理果實蔗糖含量高與對照的主要原因。圖2

圖2 環(huán)剝下果實發(fā)育期中性轉(zhuǎn)化酶、酸性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性變化
Fig.2 Effects of Girdling on activities of Al, NI, SPS, SS(SSs,SSd) during Fruit Development

2.3 環(huán)剝處理棗果實糖積累與蔗糖代謝相關(guān)酶活性的相關(guān)性

在環(huán)剝口愈之前，環(huán)剝處理果實的果糖與AI活性呈顯著正相關(guān)(0.998*)，總糖與SS合成方向活性呈顯著負相關(guān)(-0.997*)；對照的總糖與AI活性呈顯著負相關(guān)(-0.999*)。表1

8月15日果實白熟期，環(huán)剝處理的果糖與NI活性呈極顯著正相關(guān)(1.000**)，對照的總糖與NI活性呈顯著正相關(guān)(0.998*)。9月15日果實全紅期，環(huán)剝處理的果糖與NI活性呈顯著正相關(guān)(0.998*)，對照的蔗糖與SPS活性呈顯著負相關(guān)(-0.998*)。10月15日果實成熟期，環(huán)剝處理的總糖與SS合成方向活性呈顯著正相關(guān)(0.998*)，對照的葡萄糖與SPS和SS合成方向活性呈顯著正相關(guān)(0.999*)，蔗糖和總糖與SS合成方向活性呈顯著正相關(guān)(0.999*)。環(huán)剝處理影響了灰棗果實發(fā)育過程中蔗糖代謝相關(guān)酶的活性，進而影響果實糖分的代謝和積累。成熟期果實葡萄糖的積累受SPS和SS-s的影響較大，蔗糖的積累與SS-s密切相關(guān)。

3 討 論

目前的研究普遍認為，環(huán)剝主要是阻斷了韌皮部的運輸，阻止光合作用制造的有機物向根部運輸[10]。利用14C追蹤技術(shù)研究表明，環(huán)剝完全阻斷了荔枝葉片合成的光合產(chǎn)物通過主干向根系的運輸，有利于光合產(chǎn)物在地上部的累積[11]。環(huán)剝中斷葡萄韌皮部運輸途徑，中斷碳素營養(yǎng)向下運輸，使光合產(chǎn)物集中供應環(huán)剝口上部[12]。在果實生長第二期環(huán)剝可顯著地增大早熟油桃單果重，提高等級果率，增加果實內(nèi)可溶性固形物的含量[13]。環(huán)剝不但可提高椪柑葉片糖和淀粉含量，而且可提高果實的可溶性固形物含量，改善果實的品質(zhì)，其中一個主要的原因就是環(huán)剝阻礙光合產(chǎn)物等通過韌皮部向下運輸，使光合產(chǎn)物在椪柑葉片內(nèi)積累是導致葉片淀粉和糖含量增加[14]。環(huán)剝處理可顯著提高荔枝果實中可溶性糖含量，果實蔗糖含量[15]。以棗為材料的環(huán)剝研究主要集中在冬棗上。在盛花期進行主干環(huán)剝及主枝環(huán)割可明顯提高冬棗坐果率、產(chǎn)量及果實的VC、總酸、總糖和可溶性固形物含量；而在盛花后期進行環(huán)剝與環(huán)割，可提高棗果縱橫徑及單果質(zhì)量，促使果實膨大[8]。對環(huán)剝寬度與果實品質(zhì)關(guān)系的研究表明，環(huán)剝寬度1.2 cm的冬棗果實在含糖量和可溶性蛋白含量方面顯著高于其它處理和對照[9]。環(huán)剝明顯提高了灰棗果實果糖、葡萄糖和果實發(fā)育后期的蔗糖含量，環(huán)剝有利于果實果糖、葡萄糖和蔗糖的積累。果實成熟期蔗糖高于果糖和葡萄糖的含量，蔗糖和還原糖的比值為1.2∶1，灰棗果實以積累蔗糖為主，這與靈武長棗的研究結(jié)果一致[16]。

表1 環(huán)剝處理棗果實糖積累與蔗糖代謝酶活性的相關(guān)性
Table 1 Relation between sugar accumulation and sucrose-metabolizing enzymes in fruitsbefore Girdling healing

不同生長階段Differentgrowthstages環(huán)剝口愈合前Beforegirdlinghealing果實白熟期Fruitwhitematurity果實全紅期Fruitfullred果實成熟期Fruitripening環(huán)剝Girdling對照Control環(huán)剝Girdling對照Control環(huán)剝Girdling對照Control環(huán)剝Girdling對照Control果糖NI-0.9690.2971.000??0.9730.998?0.9640.7180.386FructoseAI0.998?-0.714-0.5020.9250.265-0.2710.4260.977SPS-0.771-0.536-0.573-0.6530.556-0.3880.9530.567SS-d-0.9950.183-0.1690.1950.6170.8760.5530.985SS-s-0.3-0.6160.4700.913-0.554-0.983-0.6020.497葡萄糖NI-0.855-0.0810.9790.9390.313-0.1860.869-0.550GlucoseAI0.9390.545-0.6780.981-0.796-0.7440.9880.367SPS-0.5510.339-0.381-0.963-0.564-0.656-0.0241.000??SS-d-0.981-0.393-0.3790.7050.9600.0470.9540.693SS-s-0.5650.4300.2670.9860.9790.597-0.9350.997?蔗糖NI00-0.6360.865-0.2880.6710.8740.271SucroseAI00-0.3360.9330.811-0.9820.9890.943SPS00-0.996-0.9950.585-0.998?-0.0130.663SS-d000.6430.817-0.9530.824-0.9390.599SS-s000.9770.943-0.974-0.2790.9580.999?總糖NI0.0220.9020.9850.998?0.8420.3880.9610.285TotalsugarAI0.172-0.999?0.6520.9960.784-0.9890.9970.948SPS0.447-0.983-0.413-0.8480.940-0.9640.2100.652SS-d-0.324-0.596-0.3470.4770.0310.591-0.992-0.587SS-s-0.997?-0.9960.3000.993-0.0470.0540.998?0.998?

注：**.在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；*.在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)

Note:**.Correlation is significant at the level 0.01(2-tailed)；*.correlation is significant at the level 0.05(2-tailed)

關(guān)于環(huán)剝與果實內(nèi)相關(guān)酶的關(guān)系方面前人的研究已取得一定成果。環(huán)剝可顯著抑制紅富士蘋果果實的發(fā)育，極顯著提高淀粉酶活性，降低酸性轉(zhuǎn)化酶活性；而對中性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶活性無顯著影響[17]。對著生一個果實的蘋果莖或短枝進行完全摘葉和環(huán)剝韌皮部(D/G)處理，結(jié)果導致處理果實的山梨醇脫氫酶(SDH)活力、山梨醇含量和淀粉含量的下降。再將經(jīng)D/G處理果實的皮層組織培養(yǎng)在200 mmol/L的山梨醇或葡萄糖緩沖液中，重新獲得了失去的SDH活力，而對照果實皮層組織培養(yǎng)在上述緩沖液中時，SDH活力保持不變。說明蘋果果實的SDH活力受摘葉、環(huán)剝等影響碳水化合物供給的措施調(diào)節(jié)，特異的碳水化合物如山梨醇或葡萄糖可能是調(diào)節(jié)SDH活力的信號分子[18]。調(diào)控靈武長棗果實內(nèi)蔗糖代謝的關(guān)鍵酶為蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶，尤其是蔗糖合成酶合成方向SSs 在‘靈武長棗’果實的糖代謝中起主要的調(diào)控作用[16]。研究中在全紅期至成熟階段環(huán)剝處理果實SSs活性的顯著高于對照，說明SSs對提高果實蔗糖含量具有重要貢獻。而果實遮光處理會增加靈武長棗果實中蔗糖合成酶分解方向的活性，而降低了其蔗糖合成酶合成方向酶的活性[19]。這從另一個方面也反證了SSs 與蔗糖積累的重要性。這可能暗示SSs 是以蔗糖積累為主的棗果實中調(diào)控蔗糖積累的主要酶。鑒于SSs 可能在以蔗糖積累為主的棗果實中蔗糖積累的重要性，在今后有必要針對SSs 與蔗糖積累的關(guān)系開展進一步的研究。

另外，有研究表明環(huán)剝會影響葉片內(nèi)部相關(guān)酶的活性。環(huán)剝能降低毛葉棗葉片硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶的活性，導致葉片總N含量降低，使葉片可溶性總糖、蔗糖和淀粉含量增加[20]。而果實內(nèi)的糖有是由葉片合成的光合產(chǎn)物通過韌皮部運輸進入果實積累而來[21]。據(jù)此推測，環(huán)剝對葉片內(nèi)部相關(guān)酶活性的影響，也會間接影響果實內(nèi)糖的積累。這有待于進一步研究。

4 結(jié) 論

環(huán)剝處理和對照的果實在整個發(fā)育過程中，果糖、葡萄糖和蔗糖3種可溶性糖的含量變化基本一致，其積累隨著果實的發(fā)育總體呈上升趨勢。環(huán)剝處理果實3種糖的含量總體高于同期對照果實的含量，說明環(huán)剝有利于灰棗果實果糖、葡萄糖和蔗糖的積累。其中，果糖和葡萄糖含量在9月15日(果實全紅期)前呈逐漸升高的趨勢，進入全紅期后緩慢下降；果實進入轉(zhuǎn)色期蔗糖開始緩慢積累，果實白熟期蔗糖快速積累，果實進入全紅期后蔗糖積累又趨于緩慢，至果實成熟時環(huán)剝和對照果實中蔗糖含量均超過163 mg/g，遠高于果糖和葡萄糖的含量，蔗糖和還原糖的比值為1.2∶1，灰棗果實以積累蔗糖為主。

環(huán)剝有助于提高環(huán)剝口愈合前果實內(nèi)中性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶的活性，同時宜有助于提高白熟期至成熟期間果實內(nèi)蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶合成方向的活性，而降低果實轉(zhuǎn)色期之后酸性轉(zhuǎn)化酶活性。由此說明，環(huán)剝影響了果實發(fā)育過程中蔗糖代謝相關(guān)酶的活性，進而影響果實糖分的代謝和積累。其中，果實全紅期至實成熟，環(huán)剝處理果實的蔗糖合成酶合成方向活性顯著高于對照，是環(huán)剝處理果實蔗糖含量高與對照的主要原因。