HPLC用于蛇莓中對羥基桂皮酸的含量測定

許聰聰 林鷺 梁惠芬 安紅梅 胡兵 張彤 浦益瓊

[摘要] 目的 建立蛇莓藥材中對羥基桂皮酸的高效液相色譜測定法。 方法 采用Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-0.2%醋酸（14∶86）為流動相，等度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為300 nm，柱溫30℃。結果 對羥基桂皮酸濃度在0.413～26.450 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，線性回歸方程為Y=72.592X +1.1304（r = 0.9999），平均加樣回收率為103.52%，RSD為2.61%。3批蛇莓中對羥基桂皮酸的含量分別為0.11、0.10、0.05 mg/g。 結論 該方法方便快速，其分離效果好，靈敏度高，重復性好，可用于蛇莓藥材的質量控制。

[關鍵詞] 蛇莓;對羥基桂皮酸;高效液相色譜法;含量測定

[中圖分類號] R284.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（a）-0033-05

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of p-hydroxycinnamic in Duchesnea indica （Andr.） by HPLC. Methods Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm） column was used as the column， acetonitrile-0.2% acetic acid solution （14∶86） was used as the mobile phase of the isocratic elution， with the detection wavelength of 300 nm and the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature maintained at 30℃. Results The concentration of hydroxycinnamic acid in the range of 0.413-26.450 μg/mL showed a good linear relationship with the peak area， with the equation of linear regression of Y=72.592X +1.1304 （r = 0.9999 ）. The average recovery rate was 103.52% （RSD = 2.61%）. The average content of p-hydroxycinnamic acid in 3 batches of Duchesnea indica （Andr.） determined was 0.11， 0.10 and 0.05 mg/g， respectively. Conclusion The method is convenient and rapid， and has good separation effect， high sensitivity and good repeatability. It can be used for quality control of Duchesnea indica （Andr.）.

[Key words] Duchesnea indica （Andr.） Focke; p-hydroxycinnamic; High performance liquid chromatography; Content determination

蛇莓為薔薇科植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.） Focke的全草，別名寶珠草、三葉莓、地莓、三點紅、蛇含草、野楊梅等，為民間常用草藥，在我國分布廣泛[1-2]。蛇莓以全草入藥，性味甘、苦、寒，入肺、肝、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、散瘀消腫、收斂止血、涼血之功效，用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、咳嗽吐血、疔瘡癰腫、蛇蟲咬傷、濕疹、痢疾等[3-4]。藤龍補中湯[5]是龍華醫(yī)院臨床驗方，由藤梨根、蛇莓、龍葵、白術、茯苓、槲寄生、半枝蓮等組成，可用于大腸癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤的治療，而蛇莓是藤龍補中湯組方的君藥之一。目前，相關研究[6-10]表明，蛇莓具有抗腫瘤、抑菌、增強免疫功能的效果，且對心血管、平滑肌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內分泌也有一定的作用，該中藥還具有顯著的抗腫瘤活性，引起國內外學者的廣泛關注。

蛇莓所含化合物種類繁多，已經(jīng)從中分離得到的化合物約有70多種，可大致分為6類，包括三萜類、黃酮類、鞣花酸類、香豆素類、甾醇類以及簡單的有機酸[11-12]。其中，從蛇莓中分離得到的對羥基桂皮酸在中藥回心草、千里光以及淡竹葉等多味中藥中均有發(fā)現(xiàn)[13-15]。對羥基桂皮酸能刺激成骨細胞的骨形成，并通過拮抗核因子κB的活化抑制體外破骨細胞骨吸收[16];對羥基桂皮酸在體外與骨轉移MDA-MB-231人乳腺癌細胞共培養(yǎng)的小鼠骨髓細胞中，可抑制成骨細胞礦化的抑制和破骨細胞生成的增強[17]，該成分在治療胰腺癌、乳腺癌等癌癥骨轉移中發(fā)揮作用[18-19]。另外，對羥基桂皮酸通過抑制角質形成細胞活化和下調T細胞分化和細胞因子產(chǎn)生作用，可能對特應性皮炎具有治療潛力[20]。因此，本研究以蛇莓中的對羥基桂皮酸為指標，建立了其快速、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的測定方法，以期為蛇莓的藥材質量評價研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 series高效液相色譜儀（VWD檢測器、四元恒流泵、在線脫氣機、自動進樣器）（美國安捷倫公司）、BS 124S萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）、XS105DU十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）、HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、SB3200超聲波清洗器（寧波新芝生物科技公司）。

1.2 試藥

對羥基桂皮酸（上海譽恩生物科技有限公司，批號：240072-201801，HPLC≥98%）;甲醇、乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純。

蛇莓飲片購自上海康橋中藥飲片有限公司和上海華宇藥業(yè)有限公司，批號分別為160111（上海康橋中藥飲片有限公司）、2017082803（上海華宇藥業(yè)有限公司）和171202（上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆?，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學生藥教研室張紅梅博士鑒定為植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.）的干燥全草。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.2%醋酸溶液（14∶86），等度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長300 nm，柱溫25℃，進樣量10 μL。

該條件下，樣品中對羥基桂皮酸色譜分離的理論塔板數(shù)>10000，分離度>1.5，對稱因子為0.95～1.05，符合定量測定的色譜分離要求。見圖1。

2.2 供試品溶液制備方法考察

2.2.1 提取溶劑考察? 取蛇莓藥材（2017082803）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入不同濃度的甲醇溶液（50%、70%、100%）各25 mL，稱定重量，超聲處理2次（功率250 W，頻率50 kHz），每次30 min，濾過，合并2次濾液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別注入高效液相色譜儀中，測定蛇莓中對羥基桂皮酸的含量。提取溶劑為70%甲醇時的提取效果較為理想。見表1。

2.2.2 溶劑體積考察? 取蛇莓藥材（2017082803）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入不同體積的70%的甲醇溶液（25、50、75 mL）稱定重量，超聲處理2次（功率250 W，頻率50 kHz），每次30 min，濾過，合并2次濾液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別注入高效液相色譜儀中，測定蛇莓中對羥基桂皮酸的含量。提取溶劑體積為50 mL的提取效果較為理想。見表2。

2.2.3 提取時間考察? 取蛇莓藥材（2017082803）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入50 mL 70%甲醇，超聲處理2次（功率250 W，頻率50 kHz），分別每次超聲15、30、45 min，濾過，合并2次濾液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別注入高效液相色譜儀中，測定蛇莓中對羥基桂皮酸的含量。提取時間為15 min的提取效果較為理想。見表3。

2.2.4 對照品儲備液制備? 精密稱定對羥基桂皮酸對照品5.29 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解、定容，制成0.529 mg/mL的對照品儲備液。

2.2.5 供試品溶液制備? 根據(jù)供試品溶液的制備方法考察結果，最終確定其制備方法為：取本品粉末（過三號篩）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理2次（功率250 W，頻率50 kHz），每次15 min，濾過，合并2次濾液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關系考察

取對羥基桂皮酸對照品儲備液適量，加一定量的甲醇，制成濃度分別為0.41、0.83、1.65、3.31、6.61、13.23、26.45 μg/mL的一系列對照品溶液。分別吸取上述的對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定。以濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），計算得到回歸方程Y=72.592X +1.1304（r = 0.9999），對羥基桂皮酸濃度在0.413～26.450 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。見圖2。

2.4 精密度試驗

分別取濃度為0.826 563、3.306 25、13.25 μg/mL對照品溶液，精密吸取該對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，連續(xù)測定6次，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積，RSD值分別為1.98%、1.42%、1.32%;精密吸取該對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，每天1針，連續(xù)測定6 d，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積，RSD值分別為2.27%、3.39%、1.57%。表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取蛇莓藥材粉末約2 g，按“2.2.5”供試品溶液的制備項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件在0、2、4、6、8、10、12、24 h進行測定，其含量分別為0.011%、0.011%、0.011%、0.011%、0.012%、0.011%、0.011%，RSD為3.90%。表明該樣品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.6 重復性試驗

取蛇莓藥材粉末約2 g，精密稱定，平行6份，按“2.2.5”供試品溶液的制備項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件條件進行測定，其含量均值為0.011%，RSD為2.82%。表明該樣品處理方法和含量測定方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量的蛇莓藥材粉末約1 g共9份，分別精密稱定，再分別加入相當于樣品中對羥基桂皮酸50%、100%、150%的對照品，按“2.2.5”供試品溶液的制備項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件進行測定，平均加樣回收率為103.52%，RSD值為2.61%。表明該方法測定對羥基桂皮酸的含量回收率高，準確性好。見表5。

2.8 樣品測定

取3批蛇莓藥材（160111、2017082803、171202）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理2次（功率250 W，頻率50 kHz），每次15 min，濾過，合并2次濾液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別注入高效液相色譜儀中，測定蛇莓中對羥基桂皮酸的含量。見表6。

3 討論

本研究考察了甲醇-磷酸水以及乙腈-醋酸水等多個流動相系統(tǒng)，確定以乙腈-0.2%醋酸水=14∶86為流動相，在該系統(tǒng)下對羥基桂皮酸與蛇莓中的其他成分得到了良好分離;考察了樣品提取方法，樣品含有大量葉綠素，干擾測定，直接用甲醇提取，其含量較低，經(jīng)系統(tǒng)比較后，確定了先使用70%甲醇提取、蒸干后再用甲醇復溶的樣品制備方法，既提高了提取效率，又減少了雜質干擾。本研究建立了蛇莓中對羥基桂皮酸的高效液相色譜定量檢測方法，該方法方便、快速、分離效果好、靈敏度高、重復性好，可用于蛇莓藥材的質量控制。

藤龍補中湯[5，21-23]是龍華醫(yī)院臨床驗方，可用于大腸癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤的治療，尤其在晚期大腸癌的治療方面發(fā)揮顯著作用。該方宗健脾解毒組方，同時結合現(xiàn)代藥理研究。既往研究[24-26]發(fā)現(xiàn)，該方可調控RKO細胞多個轉移相關基因表達，促進人結腸癌RKO細胞衰老，并可抑制大腸癌肺轉移。蛇莓作為君藥之一，發(fā)揮了其抗腫瘤作用。

單味藥蛇莓本身也具有強的抗腫瘤活性。蛇莓水提取物對小鼠移植瘤S180（多形細胞性肉瘤）、H22（肝細胞瘤）和S37（未分化小鼠肉瘤）的生長有明顯的抑制作用：當口服給藥劑量為10.4g生藥/kg時，對S37的抑瘤率為70%;而當劑量為5.2 g/kg時，對S180和H22的抑瘤率分別為59%和31%;另外，蛇莓水提物為生藥0.4 mg/mL時，對人肝癌細胞SMMC-7721、人胃癌SGC-7901和人食管癌Eca-109細胞均具有顯著的殺傷作用，殺傷率高達100%[27]。此外，蛇莓水提物對鼠肺癌LLC細胞、人胰腺癌Panc02細胞和乳腺癌MC-NeuA細胞的生長亦有較好的抑制作用[28]。

目前，對中藥蛇莓的研究主要集中在以下幾類成分：三萜類、糖苷類、有機酸、酚類物質、黃酮類等，且大多采用先提取分離、后進行系列藥理研究以確認其有效性的研究模式，并取得了一定的成效[29-30]。但是，現(xiàn)有研究大多為蛇莓提取物，未有具體單體成分的定量方法。蛇莓的有效部位主要在于哪類成分？能否從有效部位中分離得到有效的單體，并將其作為指標性成分？與主要藥理作用的有效成分及其作用機制是什么？這些問題均不明確。在現(xiàn)有研究基礎上，如采用氣質聯(lián)用法分析蛇莓中的揮發(fā)性成分（薄荷酮、百里香醌、六氫法呢基丙酮、松茸醇、傘花烴、3-甲基庚醇乙酸酯等）[31]、采用高效液相法測定其他活性成分（齊墩果酸、熊果酸、糅花酸、花色苷）的含量[32-37]，對蛇莓藥材中的其他相關活性成分進行系統(tǒng)研究和探索，并制訂量化標準，將對蛇莓的進一步質控與合理利用，乃至相關新藥的研發(fā)提供參考，從而保證并優(yōu)化臨床用藥。

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（收稿日期：2018-01-02? 本文編輯：王? ?蕾）