基于化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析技術(shù)檢測(cè)單增李斯特菌

范龍興，寧保安，孫智勇，白家磊，彭媛，曲曉辰，劉超，烏恩琦，高志賢，*，劉穎，*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010110；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究

所天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300050；3.中國(guó)人民解放軍第十一醫(yī)院，新疆伊寧835000）

基于化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析技術(shù)檢測(cè)單增李斯特菌

范龍興1，2，寧保安2，孫智勇3，白家磊2，彭媛2，曲曉辰1，劉超2，烏恩琦1，高志賢2，*，劉穎1，*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010110；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究

所天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300050；3.中國(guó)人民解放軍第十一醫(yī)院，新疆伊寧835000）

探索化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析技術(shù)在單核細(xì)胞增生性李斯特菌檢測(cè)中的應(yīng)用，并初步建立和優(yōu)化檢測(cè)方法及條件。將抗LM兔多抗與磁性微球偶聯(lián)構(gòu)建免疫磁分離原件，應(yīng)用雙抗夾心法ELISA檢測(cè)LM全菌抗原，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行定量檢測(cè)，應(yīng)用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化主要反應(yīng)條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)試靈敏性與特異性。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化的反應(yīng)條件為37℃條件下，免疫磁珠用量20μL、含0.1%BSA的PBS封閉15min，捕獲抗原2 h，HRP標(biāo)記的抗LM單抗稀釋至1∶10 000（體積比）特異性結(jié)合反應(yīng)30min后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合優(yōu)度0.954，最低檢出限104CFU/mL，特異性良好，檢測(cè)時(shí)限為3h～4 h。

化學(xué)發(fā)光；免疫磁珠；單增李斯特菌

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是有著強(qiáng)大致死能力的食源性致病菌之一，其感染致命性僅次于沙門氏菌[1-3]。單增李斯特菌廣泛存在于自然環(huán)境中，且在4℃條件下仍能緩慢生長(zhǎng)，人類主要通過(guò)受其污染的肉乳及其制品感染而發(fā)病[4-5]。因此，我國(guó)對(duì)食源性單增李斯特菌的檢測(cè)十分重視。目前，我國(guó)檢測(cè)單增李斯特菌的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法[6]，但過(guò)長(zhǎng)的檢測(cè)周期和繁瑣的操作仍然無(wú)法滿足快速檢驗(yàn)的要求。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）自提出以來(lái)，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)，但常規(guī)的ELISA需要復(fù)雜的樣品前處理和繁瑣的洗脫程序，這同樣使檢測(cè)過(guò)于耗時(shí)，且靈敏性和特異性受到一定影響[7-8]?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（chemiluminescence immunoassay，CLIA）有著較高的靈敏性，近年來(lái)備受學(xué)者們的關(guān)注[9-10]。同時(shí)，隨著新興的磁性納米材料的研究和發(fā)展，應(yīng)用免疫磁分離技術(shù)（immunomagnetic separation，IMS）使得簡(jiǎn)化樣品前處理和快速富集目標(biāo)物成為可能[11-13]。本研究以單增李斯特菌為目標(biāo)物，將化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)、磁分離技術(shù)與夾心法ELISA相結(jié)合，旨在探索并建立一個(gè)快速靈敏的食源性致病菌檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

雄性新西蘭白兔：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 菌株

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（L.monocytohenes，LM）、英諾克李斯特菌（L.Innocua，LI）、威爾斯李斯特菌（L.Welshimeri，LW）、大腸桿菌O157：H7（E.Coli O157：H7，O157：H7）、沙門氏菌（Salmonella，Sal）、金黃色葡萄球菌（S.Aureus，SA）：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所凍存。

1.1.3 主要試劑

含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯TSB-YE：中國(guó)Solarbio公司；弗氏完全/不完全佐劑：美國(guó)Sigma公司；Protein A瓊脂糖凝膠親和層析柱、PD-10脫鹽柱：美國(guó)General Electric公司；Dynabeads M-270環(huán)氧基磁珠抗體偶聯(lián)試劑盒、Pierce增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物液：美國(guó)Themo Fisher公司；HRP標(biāo)記抗LM鼠源單抗：英國(guó)abcam公司。

1.1.4 主要儀器

DRP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：中國(guó)森信公司；ZWY-100H溫控回旋臺(tái)式震蕩器：中國(guó)上海智誠(chéng)公司；渦旋振蕩器；HS-3型垂直混合儀：中國(guó)寧波新芝公司；DynaMag-2磁分離器、Multiskan MK3酶標(biāo)儀、Fluoroskan AscentFL熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀：美國(guó)Themo Fisher公司。

1.1.5 主要分析軟件

Image J1.45：美國(guó)softonic公司；SPSS 22.0：美國(guó)IBM公司。

1.2 方法

1.2.1 全菌滅活抗原的制備

將上述保存于-80℃的菌株復(fù)蘇純化，接種于含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37℃震蕩增菌16 h，4℃、4 000 r/min離心10min去除培養(yǎng)基，重懸于pH7.4PBS緩沖液中，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。應(yīng)用終濃度0.4%甲醛溶液37℃滅活24小時(shí)，4℃、4 000 r/min離心10min更換緩沖液除去甲醛，將滅活抗原濃度定溶至109CFU/mL，4℃保存。

1.2.2 免疫磁珠的制備

取成年健康雄性新西蘭白兔2只行四點(diǎn)免疫（頸背部皮下2點(diǎn)、后肢肌肉2點(diǎn)），每只1mL抗原量，每次免疫追加抗原用量，每次免疫間隔2周，第3次免疫后進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)，梯度至1∶104～1∶105（體積比）時(shí)，腹腔麻醉后行頸總動(dòng)脈取血。兔源抗LM IgG多克隆抗體粗純化采用辛酸-硫酸銨法，再采用親和層析法進(jìn)一步純化多克隆IgG抗體，最后進(jìn)行蛋白定量及特異性檢測(cè)。參照DynabeadsM-270環(huán)氧基磁珠抗體偶聯(lián)試劑盒說(shuō)明書，按30μg抗體/mg磁性微珠比例偶聯(lián)，免疫磁性微球定溶至10mg/mL，4℃保存。

1.2.3 檢測(cè)方法的建立及條件優(yōu)化

偶聯(lián)有兔源抗LM IgG多抗的免疫磁性微珠作為捕獲元件，HRP標(biāo)記的抗LM鼠源IgG單抗作為檢測(cè)抗體，建立200μL反應(yīng)體系的雙抗夾心化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法檢測(cè)單增李斯特菌?？乖瓭舛葹?06CFU/mL，根據(jù)正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 確定檢出限及特異性

用pH7.4 PBS緩沖液將單增李斯特菌全菌抗原稀釋至103CFU/mL～108CFU/mL，根據(jù)1.2.3建立的方法進(jìn)行靈敏性檢驗(yàn)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)用濃度為106CFU/mL的單增李斯特菌、英諾克李斯特菌；威爾斯李斯特菌、大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌、金葡菌滅活全菌抗原對(duì)1.2.3建立的方法進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。

1.2.5 模擬實(shí)際樣品檢測(cè)

將單增李斯特菌滅活全菌按105、106、107CFU/mL加入牛肉浸膏培養(yǎng)基中混勻，應(yīng)用1.2.3建立的方法進(jìn)行回收檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 兔源抗LM IgG多抗效價(jià)及特異性

第5次免疫后間隔1周耳緣靜脈采血檢測(cè)抗血清效價(jià)及特異性?？寡逍r(jià)見(jiàn)圖1，將抗血清按梯度稀釋后與106數(shù)量級(jí)各滅活全菌抗原進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。各梯度吸光值與陰性血清1∶1 000（體積比）稀釋吸光值之比大于2.1為判斷標(biāo)準(zhǔn)，效價(jià)可達(dá)1∶64 000～ 1∶128 000（體積比），抗血清特異性良好，僅對(duì)英諾克李斯特菌和威爾斯李斯特菌有輕微非特異性反應(yīng)。多抗效價(jià)見(jiàn)圖2，抗血清純化后多抗效價(jià)可達(dá)1∶6 400～ 1∶12 800（體積比），仍有輕微非特異性反應(yīng)。

圖1 兔源抗血清效價(jià)及特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The titer and specificity of rabbit antiserum were detected

圖2 純化兔源多克隆抗體效價(jià)及特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The titer and specificity of purified rabbit polyclonal antibody were detected

2.2 檢測(cè)方法關(guān)鍵條件優(yōu)化

以107CFU/mL單增李斯特菌滅活抗原為檢測(cè)目標(biāo)物，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L27（35×24）對(duì)化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析檢測(cè)方法的關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化，主要優(yōu)化因素見(jiàn)表1。檢測(cè)指標(biāo)以相對(duì)化學(xué)發(fā)光值比表示，計(jì)算方法見(jiàn)公式1。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析檢測(cè)優(yōu)化正交設(shè)計(jì)因素水平Table1 Factor level of chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay were optimized by orthogonal design

表2 化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析檢測(cè)優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 The optimization results of orthogonal design for chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay

續(xù)表2化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析檢測(cè)優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table2 The optimization results of orthogonal design for chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay

表3 化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析檢測(cè)優(yōu)化正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variance of orthogonal design for chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay

如結(jié)果所示，免疫磁球用量A（F=5.365，p=0.036）、捕捉孵育溫度C（F=92.902，p=0.000）、捕捉孵育時(shí)間D（F=8.757，p=0.003）和檢測(cè)洗脫次數(shù)H（F=6.384，p= 0.024）的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余因素差異不顯著。故根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果并綜合專業(yè)理論及經(jīng)濟(jì)條件，選擇A1B2C2D3E1F2J2H2（即取20μL免疫磁球、封閉或沖洗15min、37℃捕捉目標(biāo)物2 h、洗脫1次、1∶10 000（體積比）稀釋檢測(cè)抗體37℃孵育30min、洗脫3次后進(jìn)行檢測(cè)）為最佳條件，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定檢出限

根據(jù)2.2優(yōu)化條件，將單增李斯特菌滅活抗原按梯度稀釋至104CFU/mL～108CFU/mL，重復(fù)試驗(yàn)每次試驗(yàn)設(shè)立3個(gè)平行孔，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定檢出限。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。

圖3 化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析檢測(cè)單增李斯特菌靈敏性試驗(yàn)結(jié)果（±S）Fig.3 Sensitivity test results of Listeria monocytogenes detected by chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay（x±S）

相對(duì)化學(xué)發(fā)光值比與濃度變化近似呈線性關(guān)系，線性擬合優(yōu)度R2=0.954。根據(jù)公式1，相對(duì)化學(xué)發(fā)光值比已排除背景值影響，故檢出限為104CFU/mL（相對(duì)化學(xué)發(fā)光值比0.203）。

2.3 化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析的特異性檢測(cè)

將單增李斯特菌及其他菌株作為抗原，檢測(cè)化學(xué)發(fā)光磁酶免疫檢測(cè)方法的特異性。特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析檢測(cè)特異性試驗(yàn)結(jié)果（x±S）Fig.4 Specific test results of chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay（x±S）

單增李斯特菌檢測(cè)值和單增李斯特菌混合抗原（Mix+）檢測(cè)值呈顯著陽(yáng)性結(jié)果，混合抗原較單純單增李斯特菌抗原相對(duì)化學(xué)發(fā)光值比偏低，可能與多抗非特異性吸附有關(guān)。其他抗原檢測(cè)值均小于0.2，故本檢測(cè)方法對(duì)單增李斯特菌有顯著的特異性。

2.4 食物樣品加標(biāo)模擬檢測(cè)

將單增李斯特菌滅活全菌抗原稀釋至105、106、 107CFU/mL，分別加入至滅菌牛奶、滅菌牛肉膏溶液、滅菌鹵肉湯中，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4后進(jìn)行模擬檢測(cè)試驗(yàn)。不同食物樣品加標(biāo)模擬試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同食物樣品加標(biāo)模擬試驗(yàn)結(jié)果（x±S）Fig.5 Simulation test results of different food samples（x±S）

如圖5所示，與標(biāo)準(zhǔn)液（pH7.4，0.01mol PBS緩沖液）相比，牛奶與牛肉膏溶液回收值較好，鹵肉汁檢測(cè)結(jié)果偏低，可能與鹵肉汁中鹽離子強(qiáng)度過(guò)高，影響抗體識(shí)別活性有關(guān)。

3 分析與討論

本研究以傳統(tǒng)的免疫分析為基礎(chǔ)，結(jié)合磁分離技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)初步建立并優(yōu)化了一個(gè)針對(duì)食品中單增李斯特菌為檢測(cè)目標(biāo)物的化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析方法。眾所周知，傳統(tǒng)的免疫分析（ELISA）方法主要依賴于高特異性抗體，而目前全國(guó)乃至全球，能識(shí)別單增李斯特菌的高特異性抗體仍然不多且售價(jià)昂貴。我們以本所凍存的單增李斯特菌菌株為抗原制備兔源抗單增李斯特菌多克隆抗體，在我們的研究中得到了識(shí)別能力良好的多抗，雖然其對(duì)英諾克李斯特菌和威爾斯李斯特菌存在一定程度的非特異性識(shí)別，但將其與磁性微球偶聯(lián)和傳統(tǒng)的酶標(biāo)板固相載體相比大大增加了反應(yīng)面積，有利于捕獲檢測(cè)樣品中的單增李斯特菌，同時(shí)相比識(shí)別能力相差不多的進(jìn)口多抗，我們節(jié)約了大量生產(chǎn)成本有著重要的經(jīng)濟(jì)效益。

目前食源性單增李斯特菌的主要有培養(yǎng)法、ELISA和PCR法等，培養(yǎng)法的主要缺點(diǎn)是用時(shí)過(guò)長(zhǎng)；ELISA法雖然檢測(cè)較為快速但其繁瑣的洗脫過(guò)程導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏性和特異性不高且難以達(dá)到定量的要求[14-16]；PCR法檢測(cè)同樣較為迅速，但其需要一個(gè)精細(xì)的樣品前處理環(huán)節(jié)，同時(shí)以來(lái)于高特異性的擴(kuò)增引物，在實(shí)際檢測(cè)中往往因此出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，從而導(dǎo)致誤判[17-19]?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)十分靈敏曾廣泛應(yīng)用于痕跡檢測(cè)[20]，本研究將傳統(tǒng)ELISA與其結(jié)合，增加了檢測(cè)中的靈敏度。應(yīng)用免疫磁微球識(shí)別檢測(cè)樣品中的目標(biāo)物簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程，使目標(biāo)物容易分離[21]。捕獲識(shí)別過(guò)程在一個(gè)動(dòng)態(tài)溶液中進(jìn)行，相比傳統(tǒng)ELISA靜置孵育，大大增加了識(shí)別載體與目標(biāo)物的接觸機(jī)會(huì)，有利于對(duì)目標(biāo)物的捕獲。

我們應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了檢測(cè)方法的主要反應(yīng)條件，簡(jiǎn)化了多余的洗脫次數(shù)，將檢測(cè)時(shí)間優(yōu)化到最少，3 h～4 h即可進(jìn)行一次試驗(yàn)。在試驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)雖然靈敏性很高，但其發(fā)光穩(wěn)定性并不好。針對(duì)這一問(wèn)題，我們?cè)谠囼?yàn)中將檢測(cè)的發(fā)光值進(jìn)行換算，以相對(duì)化學(xué)發(fā)光值比為檢測(cè)指標(biāo)，同時(shí)每次檢測(cè)需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，排除批間試驗(yàn)差異過(guò)大的問(wèn)題，使檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定容易比較。

4 結(jié)論

本研究將免疫分析技術(shù)、磁分離技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，初步建立并優(yōu)化了一個(gè)以食品中單增李斯特菌為目標(biāo)物的快速檢測(cè)方法。根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，我們發(fā)現(xiàn)該檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求不高，整個(gè)試驗(yàn)在37℃條件下進(jìn)行，所需時(shí)間3 h～4 h即可完成。試驗(yàn)操作較為簡(jiǎn)便，檢測(cè)限可達(dá)104CFU/mL，與其他菌株交叉反應(yīng)極低，具有良好的靈敏性和特異性。本研究初步建立的檢測(cè)方法一些反應(yīng)條件仍可進(jìn)一步優(yōu)化，其社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益均不容小覷，它為快速檢驗(yàn)食品中單增李斯特菌和其他食源性致病菌提供了一個(gè)良好思路。

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Detection of Listeria monocytogenes through Chemiluminescent Magnetic Enzyme Immunoassay

FAN Long-xing1，2，NING Bao-an2，SUN Zhi-yong3，BAI Jia-lei2，PENG Yuan2，QU Xiao-chen1，LIU Chao2，WU En-qi1，GAO Zhi-xian2，*，LIU Ying1，*
（1.College of Public Health，Inner Mongolia Medical University，Hohhot010110，Inner Mongolia，China；2.Tianjin Key Laboratory of Risk Assessment and Control Technology for Environment and Food Safety，Tianjin Institute of Health and Environmental Medicine，Tianjin 300050，China；3.Chinese PLA Eleventh Hospital，Yining 835000，Xinjiang，China）

To explore the application of chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay in the detection of Listeria monocytogenes，and to establish and optimize the detection methods and conditions.The magnetic beads were coupled with rabbit anti LM polyclonal antibody to structure the original of immunomagnetic separation.L.monocytogenes was detected by chemiluminescence through double antibody sandwich ELISA.Orthogonal design was used to optimize the reaction conditions，and to establish the standard curve，the sensitivity and specificity were tested.Through orthogonal design，the optimization of reaction conditions were in 37℃，immunomagnetic bead dosage of20μL，containing 0.1% BSA in PBS blocking 15min，antigen captured 2 h and HRP labeled anti LM monoclonal antibody dilution to1∶10 000（體積比）specificity binding reaction 30min after chemiluminescence detection.The goodness of fit of standard curve is 0.954，the minimum detection limit is104CFU/mL，the specificity is good，and the detection time is3 h-4 h.

chemiluminescence immunoassay；immunomagnetic beads；Listeria monocytogenes

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.027

2016-07-18

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)（2013YQ14037106）

范龍興（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：流行病與食品安全相關(guān)工作。

*通信作者：劉穎（1973—），女，副教授，碩士生導(dǎo)師；高志賢（1963—），男，研究員，博士生導(dǎo)師。