高效液相-柱后衍生-熒光檢測法測定普瑞巴林含量

郭旭光

(河南省口岸食品檢驗(yàn)檢測所，鄭州 450003)

普瑞巴林化學(xué)名為(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是γ-氨基丁酸 (Gamma-aminobutyric acid，GABA)受體激動藥，用于糖尿病性外周神經(jīng)痛及帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛的治療，以及成年患者部分性癲發(fā)作的輔助治療[1]。普瑞巴林是GABA的三位異丁基取代物[2]，紫外吸收很弱且為末端吸收[3]，目前報道的高效液相紫外檢測法都是采用205[4]或210 nm[3，5-6]為檢測波長，在該波長處測定，不但吸收弱，且因?yàn)槭悄┒宋?，會引起較大基線噪音，影響檢測靈敏度。文獻(xiàn)還報道其他普瑞巴林含量測定方法：高效液相柱前衍生紫外檢測法[7]、高效液相蒸發(fā)光散射檢測法[8]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)法[9]，上述方法操作均較繁瑣。高效液相-柱后衍生-熒光檢測法測定普瑞巴林的含量筆者未見報道，筆者研究并建立了高效液相-柱后衍生-熒光檢測法測定普瑞巴林的含量，結(jié)果表明該方法操作簡便，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠，可以更好地測定普瑞巴林的含量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695高效液相色譜儀；2475 FLR Detector熒光檢測器；Waters柱后衍生系統(tǒng)，Empower 3色譜工作站；梅特勒T5自動電位滴定儀；XPE205分析天平(梅特勒-托利多公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 普瑞巴林對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：101106-201001，含量：99.8%)；普瑞巴林(雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：4003161002，4003161003，14003161004)；0.05%氫氧化鈉(NaOH)溶液(Pickering公司，批號：CB130)，鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde，OPA)稀釋液(Pickering公司，批號：CB910)；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：Waters C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(15：85)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：λex334 nm，λem455 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；衍生劑流速：0.3 mL·min-1。

取線性關(guān)系測定所用對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑，在上述色譜條件下進(jìn)樣，普瑞巴林保留時間約10.9 min，理論板數(shù)9658，空白溶劑無干擾，色譜圖見圖1。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液的制備 精密稱取普瑞巴林約20 mg，置100 mL量瓶，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5 mL置50 mL量瓶，加50%甲醇水稀釋至刻度，搖勻，即得。

A.空白對照；B.對照品；C.供試品；1.普瑞巴林。

A.blank control；B.control；C.test sample；1.pregabalin.

Fig.1HPLCchromatogramsofthreekindsofsolution

2.2.2OPA衍生液的制備 在衍生瓶中加入鄰苯二甲醛稀釋液(CB910)945 mL，稱取鄰苯二甲醛溶液100 mg置于甲醇10 mL中，經(jīng)孔徑0.45 μm有機(jī)膜濾過，將濾液加入衍生瓶；將巰基乙醇2 g溶解在鄰苯二甲醛稀釋液5 mL中，孔徑0.45 μm有機(jī)膜濾過，然后加入到衍生瓶，搖勻，即得。

2.3線性關(guān)系考察 取普瑞巴林對照品約40 mg，精密稱定，置100 mL量瓶，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液，精密吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0，2.0，2.5，5.0，8.0，10.0 mL，分別置50 mL量瓶，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按照以上色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，以普瑞巴林質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程：Y=1.617E+08X-7.602E+07(r=0.999 5)，結(jié)果表明普瑞巴林在8～80 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4精密度實(shí)驗(yàn) 取樣品(批號：4003161002)制備的供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，其峰面積RSD=0.56%。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號樣品(批號：4003161002)6份，分別按供試品溶液制備項(xiàng)下平行制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，測定。結(jié)果表明樣品中普瑞巴林平均含量99.72%，RSD=0.68%。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取樣品(批號：4003161002)制備的供試品溶液，按上述色譜條件分別于0，2，4，6，8，12 h測定，其峰面積的平均值為3 162 708 584，RSD=0.26%。

2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量樣品(批號：4003161002)適量，加入對照品適量，按“2.2”項(xiàng)配制成相當(dāng)于含量測定濃度80%，100%，120%的供試品溶液各3份。按上述色譜條件，測定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。平均加樣回收率99.82%，RSD=0.80%。

表1 普瑞巴林加樣回收率測定結(jié)果

2.8樣品含量測定 取樣品3批，依法制備供試品液，分別按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測定其峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，同時取上述3批樣品各約0.1 g，用醋酸40 mL溶解，0.1 mol·L-1高氯酸滴定液電位滴定法測定含量。結(jié)果兩種方法測定含量基本一致，見表2。

表2 兩種方法樣品含量測定結(jié)果比較

Tab.2Comparisonofcontentdeterminationonthesamplesbyusingtwomethods

批號本文方法含量RSD電位滴定法含量RSD400316100299.70.699.80.3400316100399.90.599.50.2400316100499.70.599.60.2

3 討論

取上述對照品線性溶液，固定激發(fā)波長于330 nm處，在390～490 nm范圍內(nèi)掃描發(fā)射波長，結(jié)果在455 nm處有最大吸收；固定發(fā)射波長于455 nm處，在300～435 nm范圍內(nèi)掃描激發(fā)波長，結(jié)果在334 nm處有最大吸收。故檢測激發(fā)波長定為334 nm，發(fā)射波長定為455 nm。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中分別考察4種樣品溶解溶劑：水[5]、甲醇[2]、50%乙腈[7]和50%甲醇，結(jié)果50%甲醇和50%乙腈相對水和甲醇能很好地溶解樣品，且都能符合系統(tǒng)適用性專屬性要求，考慮甲醇相對乙腈更經(jīng)濟(jì)且毒性小，本實(shí)驗(yàn)流動相組成又為甲醇-水系統(tǒng)，50%甲醇也能更好地降低溶劑效應(yīng)，故選50%甲醇做溶劑。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中考察了流動相：甲醇-乙腈-20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)(350：100：550)[3]、水-乙腈(85：15)和水-甲醇(85：15)，結(jié)果3種流動相均能滿足檢測系統(tǒng)適用性要求，但第一種流動相組成響應(yīng)相對較低，后兩種流動相除了在保留時間有差別，峰型均對稱尖銳，響應(yīng)較好，考慮經(jīng)濟(jì)、簡便，選擇水-甲醇(85：15)作為流動相組成。本法操作簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏、專屬性強(qiáng)，適用于普瑞巴林的含量測定。