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    不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖的抗氧化活性

    2019-10-30 05:32:20聶琳然郝利民王滔滔張黎明魯吉珂康彩彩韓培培賈士儒
    食品科學(xué) 2019年19期
    關(guān)鍵詞:孔菌酵母自由基

    聶琳然,郝利民,*,王滔滔,劉 陽,張黎明,魯吉珂,3,康彩彩,崔 燕,韓培培,賈士儒,*

    (1.天津科技大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457;2.軍事科學(xué)院軍需工程技術(shù)研究所,北京 100010;3.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450001)

    機體長期處于輻射、高壓、缺氧等應(yīng)激環(huán)境時會產(chǎn)生大量自由基,過多的自由基會對機體造成嚴(yán)重的氧化損傷,進而引發(fā)癌癥、糖尿病和動脈粥樣硬化等多種疾病[1-2]??寡趸瘎┠軌蛴行Ц纳蒲趸瘧?yīng)激損傷,天然抗氧化劑具有來源廣、毒性低、無副作用等優(yōu)勢,是當(dāng)前研究的熱點[3]。食藥用真菌富含多糖、多酚、黃酮等多種抗氧化活性物質(zhì),不僅能有效清除多種自由基,還可與金屬離子絡(luò)合減少自由基的產(chǎn)生[4-5],其開發(fā)前景廣闊。

    紅緣擬層孔菌(Fomitopsis pinicola)又名“紅緣層孔菌”、“紅緣多孔菌”、“紅緣樹舌”等,是一種藥用價值較高的大型真菌,紅緣擬層孔菌在我國分布較廣,且以我國東北地區(qū)最為常見[6];其味微苦、性平,具補肺益腎、安神定志、扶正培本、滋補強壯和祛風(fēng)除濕等作用,對腎炎、支氣管炎、癌癥、心臟病、糖尿病等有特效,民間常用于治療“寒腿”病[7]。據(jù)報道,紅緣擬層孔菌水提物具有抗腫瘤、抗菌抗炎、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用[8]。多糖是紅緣擬層孔菌的主要生物活性成分之一,具有抗氧化、抗腫瘤、保肝護肝等多種活性[9-12],在保健食品、功能性化妝品和抗腫瘤藥物的開發(fā)方面具有很好的前景。近年,紅緣擬層孔菌多糖抗氧化活性的主要研究對象為子實體多糖,對不同來源紅緣擬層孔菌多糖抗氧化活性的對比研究報道甚少。不同來源的多糖在結(jié)構(gòu)或組成上有明顯差異,且對紅緣擬層孔菌進行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng),可有效解決其子實體生長周期長、自然資源少、培植難度大等問題。本實驗對3 種不同產(chǎn)地(吉林、黑龍江、云南)紅緣擬層孔菌子實體、菌絲體及其發(fā)酵液多糖的抗氧化活性進行比較研究,可為了解不同產(chǎn)地紅緣擬層孔菌子實體、菌絲體及其發(fā)酵液多糖的抗氧化活性差異提供參考依據(jù),有助于紅緣擬層孔菌的開發(fā)利用。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、材料與試劑

    紅緣擬層孔菌(Fomitopsis pinicola)菌種由軍事科學(xué)院軍需工程技術(shù)研究所提供;紅緣擬層孔菌子實體分別購自吉林、黑龍江、云南,經(jīng)軍事科學(xué)院軍需工程技術(shù)研究所鑒定。

    釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)A.S.2399由天津科技大學(xué)省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室保藏。

    1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2’-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt,ABTS)、牛血清白蛋白 美國Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    種子培養(yǎng)基:葡萄糖30 g/L、酵母粉5 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 10 g/L,pH 6;發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖50 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 10 g/L,pH 5;酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YEPD)培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L,自然pH值。在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加質(zhì)量分數(shù)2%的瓊脂制備固體培養(yǎng)基。

    1.2 儀器與設(shè)備

    JA12002型電子天平 上海精科天平儀器廠;PHSJ-4A型pH計 上海雷磁儀器廠;TDA-8002型恒溫水浴鍋天津市中環(huán)試驗電爐有限公司;TGL16G型離心機 上海醫(yī)用分析儀器廠;RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;ALPHA 1-4/LD型冷凍干燥機 德國CHRIST公司;QL-902型漩渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;UVmini-1240型紫外-可見分光光度計 島津國際貿(mào)易(上海)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 紅緣擬層孔菌粗多糖的制備

    將紅緣擬層孔菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,在28 ℃、180 r/min下培養(yǎng)4.5 d,過濾分別得紅緣擬層孔菌菌絲體(Fomitopsis pinicola mycelium,F(xiàn)PM)及其發(fā)酵液(F. pinicola fermentation broth,F(xiàn)PFB),F(xiàn)PM冷凍干燥。紅緣擬層孔菌子實體(F. pinicola fruiting body,F(xiàn)PF)為自然風(fēng)干,粉碎處理后,烘干至恒質(zhì)量。

    分別取FPM凍干粉及3 種不同產(chǎn)地(吉林、黑龍江、云南)FPF(分別記為JFPF、HFPF、YFPF)烘干粉各50 g,按料液比1∶25(m/V)加入蒸餾水,熱水浸提(85 ℃、2 h)2 次,抽濾合并濾液,得多糖提取液。各多糖提取液和FPFB分別濃縮至原體積的1/5,加入3 倍體積95%(體積分數(shù),下同)乙醇溶液,4 ℃醇沉12 h,離心(10 000 r/min、8 min)收集沉淀,沉淀用95%乙醇溶液洗2~3 次后冷凍干燥,得各樣品粗多糖[13]。按式(1)計算粗多糖提取率。

    式中:m1為樣品所得粗多糖質(zhì)量/g;m2為樣品質(zhì)量/g;n為稀釋倍數(shù)。

    1.3.2 粗多糖中總糖和蛋白質(zhì)量分數(shù)的測定

    以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用苯酚-硫酸法[14]測定粗多糖中總糖質(zhì)量分數(shù);以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法[15]測定粗多糖中蛋白質(zhì)量分數(shù);以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品,采用咔唑-硫酸法[16]測定粗多糖中糖醛酸質(zhì)量分數(shù)。

    結(jié)合糖蛋白質(zhì)量分數(shù)測定:分別將5 mg/mL、60 mL的JFPF、HFPF、YFPF、FPM、FPFB 5 種粗多糖溶液與20 mL Sevag試劑(氯仿、正丁醇體積比為4∶1)混合,磁力攪拌20 min,將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗,靜置分層,去除蛋白層和氯仿相,收集水相,重復(fù)上述操作至蛋白層不再出現(xiàn),真空濃縮,冷凍干燥,得脫蛋白粗多糖。采用BCA法[15]測定脫蛋白后粗多糖中蛋白質(zhì)量分數(shù),即結(jié)合糖蛋白質(zhì)量分數(shù)。

    1.3.3 分子質(zhì)量分布的測定

    待測多糖樣品的制備:5 種粗多糖經(jīng)AB-8大孔樹脂脫色、Sevag法除蛋白、真空濃縮,冷凍干燥得待測樣品。

    采用高效凝膠滲透色譜法[17]對上述待測多糖樣品的分子質(zhì)量進行測定。色譜條件:色譜柱:TSK-GEL G4000 PW XL凝膠過濾柱(7.8 mm×30.0 cm,10 μm);流動相:超純水;流速:0.5 mL/min;檢測器:RI-101示差折光檢測器;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μL。

    將已知分子質(zhì)量的系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下測定,以分子質(zhì)量對數(shù)為橫坐標(biāo)(X(lg Mw)),保留時間(Y/min)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程:Y=-0.274 3X+5.912 2(R2=0.998 8)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算紅緣擬層孔菌多糖樣品分子質(zhì)量。

    1.3.4 體外抗氧化活性的測定

    1.3.4.1 DPPH自由基清除能力

    分別將1 mL 1.0~5.0 mg/mL的5 種多糖樣品溶液與0.5 mmol/L DPPH-乙醇溶液、60%乙醇按體積比1∶1∶10混合均勻,室溫下避光反應(yīng)30 min,于517 nm波長處測定吸光度(A517nm)??瞻捉M和樣品本底分別以等體積無水乙醇代替樣品溶液和DPPH-乙醇溶液[18]。以VC為陽性對照。按式(2)計算DPPH自由基清除率。

    式中:Ai為實驗組A517nm;Aj為樣品本底A517nm;A0為空白組A517nm。

    1.3.4.2 ABTS陽離子自由基清除能力

    將7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合并于黑暗處靜置12~16 h,用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋該混合液至其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02,得ABTS工作液。分別取1 mL 1.0~5.0 mg/mL的5 種多糖樣品溶液與ABTS工作液按體積比1∶6混合均勻,室溫下反應(yīng)6 min后于734 nm波長處測定吸光度(A734nm)??瞻捉M和樣品本底分別以等體積蒸餾水代替樣品溶液和ABTS工作液[19]。以VC為陽性對照。按式(3)計算ABTS陽離子自由基清除率。

    式中:Ai為實驗組A734nm;Aj為樣品本底A734nm;A0為空白組A734nm。

    1.3.4.3 羥自由基清除能力

    將1 mL 1.0~5.0 mg/mL的5 種多糖樣品溶液中依次加入5 mmol/L H2O2溶液、5 mmol/L FeSO4溶液、蒸餾水各2 mL,最后加入2 mL 5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,混合均勻,室溫反應(yīng)30 min,于510 nm波長處測定吸光度(A510nm)??瞻捉M和樣品本底分別以等體積蒸餾水代替樣品溶液和H2O2溶液[20]。以VC為陽性對照。按式(4)計算羥自由基清除率。

    式中:Ai為實驗組A510nm;Aj為樣品本底A510nm;A0為空白組A510nm。

    1.3.4.4 還原能力

    采用鐵氰化鉀法測定樣品的還原能力。分別將1 mL 1.0~5.0 mg/mL的5 種多糖樣品溶液與1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液、磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)按體積比1∶1∶1混合,50 ℃水浴20 min,加入2 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液,3 000 r/min離心10 min,取1 mL上清液與等體積蒸餾水和0.2 mL 0.3 g/100 mL三氯化鐵溶液混合,50 ℃水浴10 min,于700 nm波長處測定吸光度(A700nm)。樣品本底以等體積蒸餾水代替三氯化鐵溶液[21]。以VC為陽性對照。按式(5)計算還原能力。

    式中:Ai為實驗組A700nm;Aj為樣品本底A700nm。

    1.3.5 氧化損傷酵母細胞保護能力的測定

    1.3.5.1 紫外損傷酵母細胞保護能力

    將酵母菌在液體YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期,4 000 r/min離心5 min,收集菌體。用磷酸鹽緩沖液(pH 6.9)洗1~2 次,并懸浮其中得酵母菌懸液。將不同質(zhì)量濃度(4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL)的5 種多糖樣品溶液與菌懸液按體積比4∶1混合,然后在致死條件(20 W、距離30 cm,60 s)下進行紫外處理。將處理后各菌液梯度稀釋涂布于固體YEPD培養(yǎng)基中,28 ℃倒置培養(yǎng)48 h,菌落計數(shù)??瞻捉M以等體積磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液,對照組以等體積磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液且未經(jīng)紫外照射[22]。以VC為陽性對照。按式(6)計算酵母細胞存活率。

    式中:Ai為實驗組酵母單菌落數(shù);Aj為空白組酵母單菌落數(shù);A0為對照組酵母單菌落數(shù)。

    1.3.5.2 H2O2損傷酵母細胞保護能力測定

    按1.3.5.1節(jié)的方法制得酵母菌懸液。分別將4 mL不同質(zhì)量濃度(4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL)的5 種多糖樣品溶液與1 mL菌懸液于試管中混合,加入致死劑量(體積分數(shù)2%)的H2O2溶液1 mL,37 ℃水浴振蕩1 h??瞻捉M以等體積磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液,對照組以等體積磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液且未經(jīng)體積分數(shù)2%的H2O2溶液處理[22]。處理后的菌液按1.3.5.1節(jié)描述的方法培養(yǎng)后進行菌落計數(shù),按式(6)計算酵母細胞存活率。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用Microsoft Office Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理,實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖的基本組分

    不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖的基本組分見表1。FPM粗多糖得率為5.90%,明顯高于3 種子實體;在3 種子實體中,HFPF和YFPF粗多糖得率接近,分別為2.91%和2.56%,JFPF粗多糖得率最低,僅為0.75%。5 種粗多糖的總糖質(zhì)量分數(shù)存在差異,3 種子實體粗多糖的總糖質(zhì)量分數(shù)高于菌絲體粗多糖,其中YFPF粗多糖的總糖質(zhì)量分數(shù)最高,為71.65%,F(xiàn)PFB粗多糖的總糖質(zhì)量分數(shù)同樣較菌絲體粗多糖高,為56.04%。水提粗多糖中常含有部分游離蛋白質(zhì)和結(jié)合糖蛋白,因此,蛋白質(zhì)含量是粗多糖的重要檢測指標(biāo)之一[23]。由表1可知,5 種粗多糖的總蛋白質(zhì)量分數(shù)均小于13%,其中FPFB、JFPF、HFPF的總蛋白質(zhì)量分數(shù)接近,均在7%左右;FPM和YFPF的總蛋白質(zhì)量分數(shù)較其他3 種粗多糖高,分別為10.08%和12.20%。對5 種粗多糖中結(jié)合糖蛋白質(zhì)量分數(shù)進行測定發(fā)現(xiàn),JFPF、YFPF和FPM 3 種粗多糖的結(jié)合糖蛋白質(zhì)量分數(shù)較高,分別為1.08%、1.26%和2.23%。另外,5 種粗多糖樣品中糖醛酸質(zhì)量分數(shù)差異較大,HFPF和YFPF的糖醛酸質(zhì)量分數(shù)較高,分別為14.54%和15.84%,JFPF、FPM和FPFB 3 種粗多糖的糖醛酸質(zhì)量分數(shù)均在3%以下。這些粗多糖的基本組分對其抗氧化活性會有不同程度的影響。

    表1 紅緣擬層孔菌粗多糖的基本組分Table 1 Basic components of crude polysaccharides from Fomitopsis pinicola

    2.2 不同來源紅緣擬層孔菌多糖的分子質(zhì)量分布

    有研究表明,多糖的分子質(zhì)量與其抗氧化活性密切相關(guān)[24],因此測定多糖分子質(zhì)量分布對其抗氧化活性的分析是十分必要的。脫蛋白后的JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖的凝膠色譜圖和分子質(zhì)量分布分別見圖1和表2。

    圖1 脫蛋白后的5 種粗多糖的高效凝膠滲透色譜圖Fig. 1 High performence gel permeation chromatograms of five crude polysaccharides after protein removal

    表2 脫蛋白后5 種粗多糖的分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular mass distribution of five crude polysaccharides after protein removal

    由圖1可知,JFPF和FPFB粗多糖在色譜圖中呈現(xiàn)2 個相近的峰,顯示JFPF和FPFB粗多糖有2 種不同組分;HFPF和YFPF粗多糖在色譜圖中呈現(xiàn)3 個主要峰,顯示HFPF和YFPF粗多糖存在3 種不同組分;FPM粗多糖在色譜圖中呈現(xiàn)5 個峰,顯示該粗多糖有5 種不同組分。

    從表2可知,JFPF粗多糖中峰1、2的保留時間接近,分別為15.174 min和15.690 min,說明JFPF粗多糖組分分子質(zhì)量分布相對比較集中,其中峰1的峰面積占比為78.53%,分子質(zhì)量為5.62×104Da,峰2的峰面積占比為21.47%,分子質(zhì)量為4.06×104Da;HFPF粗多糖中峰1、2的峰面積占比分別為33.49%和55.81%,說明HFPF粗多糖主要由峰1和峰2組分組成,其中,峰1組分的分子質(zhì)量較高為2.07×106Da,峰2組分的分子質(zhì)量為8.63×104Da;YFPF粗多糖中有3 種不同組分,其中峰1、2的出峰時間早,分子質(zhì)量高,分別為2.95×106Da和1.17×106Da,對應(yīng)峰面積所占比例分別為43.72%、20.17%,表明YFPF中分子質(zhì)量高的組分含量較高;FPM粗多糖中的組分較豐富,但其保留時間相對集中,主要在8.971~13.827 min范圍內(nèi),其中,峰1和峰2組分的分子質(zhì)量較高,分別為2.83×106、1.78×106Da,峰3、4和峰5為FPM的主要組分,分子質(zhì)量在1.31×105~4.35×105Da范圍內(nèi);FPFB中峰1、2的保留時間接近,對應(yīng)組分的分子質(zhì)量較低,分別為3.38×104、2.75×104Da。

    通過對比可以發(fā)現(xiàn),JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB 5 種粗多糖的分子質(zhì)量構(gòu)成差異明顯,YFPF粗多糖中以2.95×106Da左右的高分子質(zhì)量多糖為其主要成分;FPM粗多糖中以1.31×105~4.35×105Da范圍的中等分子質(zhì)量多糖為其主要成分;JFPF和FPFB粗多糖分別以5.62×104Da和2.75×104~3.38×104Da的低分子質(zhì)量多糖為其主要成分;而HFPF粗多糖中高分子質(zhì)量多糖和低分子質(zhì)量多糖所占比例較均等。多糖的糖鏈與肽鏈結(jié)合,形成的糖肽或糖蛋白會增加多糖的分子質(zhì)量[25],YFPF和FPM粗多糖中多糖較高的分子質(zhì)量,可能與其較高的糖蛋白含量有關(guān)。文獻[11]報道,培養(yǎng)35 d的FPM多糖主要有3 種不同分子質(zhì)量的組分,即5.37×106(19.6%)、1.06×106Da(19.3%)的高分子質(zhì)量組分和1.47×104Da(53.6%)的低分子質(zhì)量組分,此結(jié)果與本實驗有一定差異,推測可能與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間等不同相關(guān)。本實驗中紅緣擬層孔菌多糖分子質(zhì)量分布與已報道的紅緣擬層孔菌子實體與菌絲體多糖的分子質(zhì)量遠高于其發(fā)酵液多糖分子質(zhì)量[9,11]基本吻合。

    2.3 不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖的抗氧化活性

    2.3.1 DPPH自由基清除能力

    DPPH自由基的醇溶液呈紫色,具有自由基清除能力的樣品,可與之結(jié)合使溶液顏色變淺,吸光度減小,因此可根據(jù)吸光度變化快速判斷樣品的DPPH自由基清除能力[26]。

    圖2 JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖對DPPH自由基的清除作用Fig. 2 DPPH radical scavenging activity of crude polysaccharides from JFPF, HFPF, YFPF, FPM and FPFB

    由圖2可知,5 種粗多糖對DPPH自由基均具有一定的清除作用,且存在一定的劑量依賴關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時,YFPF、JFPF、HFPF、FPM和FPFB粗多糖對DPPH自由基的清除率分別為47.01%、34.73%、27.94%、24.44%、18.75%;當(dāng)質(zhì)量濃度增加到5 mg/mL時,上述5 種多糖對DPPH自由基清除率分別為78.78%、75.92%、60.47%、41.41%、31.32%。在0~5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),5 種紅緣擬層孔菌粗多糖和VC對DPPH自由基的清除能力由大到小依次為VC>YFPF>JFPF>HFPF>FPM>FPFB。上述結(jié)果表明,5 種粗多糖可能作為電子或氫供體清除DPPH自由基。子實體粗多糖(JFPF、HFPF和YFPF)對DPPH自由基的清除作用均高于菌絲體和發(fā)酵液所得粗多糖(FPM和FPFB)。在5 種粗多糖中,以子實體中的YFPF粗多糖對DPPH自由基清除作用最強,且YFPF粗多糖的雜質(zhì)蛋白和糖醛酸含量最高。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和糖醛酸含量增加時,多糖具有較高的自由基清除活性,這與已有研究結(jié)果吻合,認為多糖分子中蛋白質(zhì)和糖醛酸物質(zhì)的存在增強了其自由基清除活性[27]。此外,多糖的分子質(zhì)量在抗氧化活性中起著重要的作用,分子質(zhì)量較低的多糖在提取過程中其主要分子結(jié)構(gòu)可能被破壞,如糖基類型、取代基和糖苷鍵的構(gòu)型等[9],因此分子質(zhì)量高的YFPF粗多糖比其他4 種粗多糖具有更高的抗氧化活性。

    2.3.2 ABTS陽離子自由基清除能力

    ABTS經(jīng)氧化后會形成在734 nm波長處有最大吸收的藍綠色水溶性ABTS陽離子自由基,抗氧化劑可與其反應(yīng)使之褪色,且抗氧化能力與反應(yīng)速率呈正相關(guān),可根據(jù)褪色情況直接判斷樣品抗氧化能力[19]。

    由圖3可知,JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖對ABTS陽離子自由基都有較強的清除作用,清除率隨多糖質(zhì)量濃度的上升而增大。在質(zhì)量濃度大于1 mg/mL時,JFPF、HFPF、YFPF和FPM 4 種粗多糖對ABTS陽離子自由基的清除效果接近陽性對照VC,且均明顯高于FPFB。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時,JFPF、HFPF、YFPF和FPM粗多糖對ABTS陽離子自由基的清除率均大于98%;而FPFB粗多糖對ABTS陽離子自由基的清除率只有72%。這可能是由于其多糖、雜質(zhì)蛋白、糖蛋白和糖醛酸含量相對較少。FPFB屬于胞外多糖,其組成、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)(包括主要多糖組分的分子質(zhì)量)與其他多糖差異也較大,因此,影響其對ABTS陽離子自由基的清除能力。

    圖3 JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖對ABTS陽離子自由基的清除作用Fig. 3 ABTS radical scavenging activity of crude polysaccharides from JFPF, HFPF, YFPF, FPM and FPFB

    2.3.3 羥自由基清除能力

    羥自由基是目前已知的機體新陳代謝過程中產(chǎn)生的對機體毒性最強、危害最大的一種活性氧自由基,是機體氧化損傷的主要因素??寡趸瘎┠苡行宄驕p少羥自由基的產(chǎn)生,從而抑制氧化發(fā)生,羥自由基清除率是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)[13,28]。

    圖4 JFPF、HFPF、YFPF、FPM及FPFB粗多糖對羥自由基的清除作用Fig. 4 Hydroxyl radical scavenging activity of crude polysaccharides from JFPF, HFPF, YFPF, FPM and FPFB

    由圖4可知,5 種粗多糖對羥自由基均具有較好的清除作用,當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時,JFPF、FPFB、FPM、YFPF和HFPF粗多糖對羥自由基的清除率依次為47.91%、36.03%、30.84%、23.35%、20.51%;當(dāng)質(zhì)量濃度增大至5 mg/mL時,JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB對羥基自由基的清除率分別為89.71%、52.68%、64.38%、71.05%、73.44%。在0~5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)各樣品對羥自由基的清除能力呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。5 種紅緣擬層孔菌粗多糖對羥自由基清除作用最強的是JFPF,然后依次為FPFB>FPM>YFPF>HFPF。這可能與多糖、雜質(zhì)蛋白、糖蛋白和糖醛酸質(zhì)量分數(shù)有關(guān)。FPFB屬于胞外多糖,它對羥自由基也具有較強的清除作用。研究表明,多糖可以作為電子或氫供體來清除羥自由基,清除羥自由基生成是一種抗氧化機制[29]。另外,JFPF和FPFB較高的羥自由基清除活性可能與它們相對較低的分子質(zhì)量有關(guān),低分子質(zhì)量多糖活性位點容易暴露,利于和自由基接觸并清除。

    2.3.4 還原能力

    還原能力是衡量物質(zhì)潛在抗氧化能力的重要指標(biāo),具有還原性的物質(zhì)可以通過自身的還原作用提供電子清除自由基,從而達到抗氧化的目的。當(dāng)還原性物質(zhì)存在時,鐵氰化鉀可被還原為亞鐵氰化鉀,與三氯化鐵在酸性條件下反應(yīng)并生成700 nm波長處有特征吸收峰的普魯士藍[30]。

    圖5 JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖的還原能力Fig. 5 Reducing power of crude polysaccharides from JFPF, HFPF,YFPF, FPM and FPFB

    由圖5可知,5 種粗多糖(JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB)均具有一定的還原能力,且在0~5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)還原能力呈一定的劑量依賴關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時,YFPF粗多糖的還原能力為0.84,其余4 種粗多糖(HFPF、JFPF、FPM、FPFB)的還原能力分別為0.34、0.32、0.25、0.10。5 種粗多糖還原能力從大到小依次為:YFPF>HFPF>JFPF>FPM>FPFB。子實體YFPF粗多糖的還原能力最高,這可能與其多糖、雜質(zhì)蛋白、糖蛋白和糖醛酸含量相對較高有關(guān)。FPFB屬于胞外多糖,其單糖組成、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)(包括主要多糖組分的分子質(zhì)量)與其他多糖差異也較大,其還原能力最差。多糖的分子質(zhì)量也是影響其抗氧化活性的主要因素之一,分子質(zhì)量較低的多糖在提取過程中其主要分子結(jié)構(gòu)可能被破壞,YFPF中分子質(zhì)量高的組分含量較高,因此,較其他粗多糖具有更高的抗氧化活性。研究表明,還原能力通常與還原酶的存在有關(guān),還原酶通過提供氫原子破壞自由基鏈,從而發(fā)揮抗氧化作用,此外,還原劑還可通過與H2O2的某些前體發(fā)生反應(yīng)防止H2O2形成,從而發(fā)揮抗氧化作用[29]。

    2.3.5 氧化損傷酵母細胞保護能力

    酵母細胞是與人體細胞接近的真核細胞,其與人體細胞的抗氧化機制相似,且生命周期短,是抗氧化活性研究的模式生物[9]。為深入考察紅緣擬層孔菌粗多糖的抗氧化活性,實驗采用氧化損傷(紫外線和H2O2)酵母細胞保護作用實驗?zāi)P?,? 種粗多糖對氧化損傷酵母細胞的保護作用進行評價。

    2.3.5.1 紫外損傷酵母細胞保護實驗結(jié)果

    紫外線輻射是造成皮膚氧化損傷的主要原因,紫外線輻射產(chǎn)生的活性氧自由基會引發(fā)細胞損傷和凋亡,進而引起動脈粥樣硬化和癌癥等相關(guān)疾病[31-32]??寡趸瘎┚哂星宄杂苫淖饔?,可有效減緩紫外輻射對細胞造成的損傷[33]。

    圖6 JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖對紫外損傷酵母細胞保護能力Fig. 6 Protective effects of crude polysaccharides from JFPF, HFPF,YFPF, FPM and FPFB against UV-induced oxidative damage in yeast cells

    5 種不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖對紫外損傷酵母細胞的保護作用結(jié)果如圖6所示。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時,JFPF、HFPF、YFPF、FPM、FPFB對應(yīng)的酵母細胞存活率均較低,分別為1.53%、2.72%、29.43%、34.84%、21.43%,表明5 種粗多糖在較低質(zhì)量濃度時對紫外損傷酵母細胞的保護作用較弱;質(zhì)量濃度增大至20 mg/mL時,上述5 種粗多糖對應(yīng)的酵母細胞存活率分別為33.14%、27.57%、64.64%、75.48%、67.71%。因此,5 種粗多糖在較高質(zhì)量濃度時對紫外損傷酵母具有較好的保護作用,且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。源于菌絲體和發(fā)酵液的粗多糖對紫外損傷酵母細胞的保護作用優(yōu)于子實體粗多糖,YFPF粗多糖對紫外損傷酵母細胞也具有較強保護作用。多糖的抗氧化活性與其雜蛋白和結(jié)合糖蛋白含量密切相關(guān),研究顯示,未脫蛋白多糖的抗氧化活性優(yōu)于脫蛋白多糖的抗氧化活性[34],Sevag法脫蛋白多糖的抗氧化活性強于蛋白酶法脫蛋白多糖[35],故推測FPM和YFPF較強的紫外損傷酵母細胞保護作用可能與其蛋白質(zhì)量分數(shù)尤其是結(jié)合糖蛋白質(zhì)量分數(shù)高有關(guān)。

    2.3.5.2 H2O2氧化損傷酵母細胞保護實驗

    H2O2是一種常用的細胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑,廣泛用于誘導(dǎo)細胞建立氧化應(yīng)激損傷模型。H2O2能在細胞內(nèi)產(chǎn)生活性高、破壞力強的羥自由基,從而對機體造成傷害。抗氧化劑可通過直接與H2O2、H2O2中間產(chǎn)物反應(yīng)或抑制過氧化物酶與H2O2結(jié)合等來降低H2O2對細胞的損傷[36]。

    圖7 JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖對H2O2損傷酵母細胞保護能力Fig. 7 Protective effects of crude polysaccharides from JFPF, HFPF,YFPF, FPM and FPFB against H2O2-induced oxidative damage in yeast cells

    5 種不同來源的紅緣擬層孔菌粗多糖對H2O2氧化損傷酵母細胞的保護作用結(jié)果見圖7。當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/mL時,F(xiàn)PM、YFPF、FPFB、JFPF和HFPF 5 種粗多糖對酵母細胞的存活率分別為48.38%、43.12%、41.74%、20.35%和18.63%。這些多糖對H2O2氧化損傷酵母細胞具有不同程度的保護作用。此結(jié)果表明,F(xiàn)PM粗多糖對H2O2氧化損傷酵母細胞保護作用最強,YFPF、FPFB粗多糖次之,這與紫外損傷酵母細胞保護作用實驗結(jié)果相似。FPM粗多糖對紫外和H2O2氧化損傷酵母細胞的保護作用均強于其他4 種,推測可能與色素、雜質(zhì)蛋白、糖蛋白和糖醛酸等物質(zhì)的存在及其之間的協(xié)同作用有關(guān),這些物質(zhì)也參與了抗氧化作用。多糖抗氧化的構(gòu)效關(guān)系受多種因素影響,包括蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量、硫酸基含量、分子質(zhì)量、單糖組成、活性羥基數(shù)量以及分子構(gòu)象等,紅緣擬層孔菌多糖的結(jié)構(gòu)特征有待于進一步系統(tǒng)解析。H2O2在細胞內(nèi)產(chǎn)生的羥自由基破壞力很強,故其存活率總體上均低于紫外處理組,這與已有研究結(jié)果[37]吻合。

    3 結(jié) 論

    本實驗分別采用4 種體外抗氧化活性評價方法以及紫外和H2O2氧化損傷酵母細胞保護實驗?zāi)P?,對JFPF、HFPF、YFPF、FPM及FPFB粗多糖的抗氧化活性進行對比研究。結(jié)果表明,5 種不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基均有較好的清除能力,且對氧化損傷酵母細胞均表現(xiàn)出較好的保護作用,表明5 種紅緣擬層孔菌粗多糖具有較好的抗氧化活性,提示這5 種粗多糖作為抗氧化功能因子在保健功能食品中具有良好的應(yīng)用前景。本研究還發(fā)現(xiàn)5 種紅緣擬層孔菌粗多糖雖然都具有較好的抗氧化活性,但作用效果差異明顯,其中,YFPF粗多糖對DPPH和ABTS陽離子自由基的清除作用及還原能力強于其他4 種粗多糖;FPM粗多糖對紫外和H2O2誘發(fā)的氧化損傷酵母細胞的保護作用均最強,原因可能與YFPF和FPM粗多糖的分子質(zhì)量較高及糖蛋白含量較高相關(guān)。多糖的結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ),因此進一步分離純化、結(jié)構(gòu)表征以及構(gòu)效關(guān)系等方面的研究工作有待進行。不同來源紅緣擬層孔菌多糖的抗氧化活性存在一定差異,液體深層發(fā)酵是制備紅緣擬層孔菌活性多糖的一種有效方法,這為紅緣擬層孔菌多糖在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域開發(fā)應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

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