光聲顯微成像技術(shù)的研究進(jìn)展

張建輝 陳寧波, 王柏權(quán), 劉成波 龔小競

（1.廣州大學(xué)機(jī)械與電氣工程學(xué)院，廣州，510006；2.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院生物醫(yī)學(xué)光學(xué)與分子影像研究室，深圳，518055）

引 言

早在1880年，Bell[1]就發(fā)現(xiàn)了光聲轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，并在給美國科學(xué)進(jìn)展協(xié)會的報(bào)告中將這種物理現(xiàn)象稱為“光聲效應(yīng)”，即光吸收體吸收經(jīng)調(diào)制的光或脈沖光后，進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)換，熱彈性效應(yīng)使吸收體介質(zhì)周期性的脹縮從而產(chǎn)生超聲波。然而，直到20世紀(jì)90年代，隨著固體光聲理論的完善，在激光、計(jì)算機(jī)和超聲探測等技術(shù)的推動下，光聲效應(yīng)在散射介質(zhì)和生物組織中應(yīng)用取得重大突破，光聲成像（Photoacoustic imaging，PAI）才被正式提出，在過去20余年間獲得空前快速的發(fā)展，并正在成為生命科學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的新型生物醫(yī)學(xué)影像技術(shù)之一。光聲成像主要包括以下過程：納秒激光脈沖照射生物組織—組織中光吸收體吸收光能量—組織熱膨脹—周期性的振動產(chǎn)生超聲波—寬帶超聲換能器探測超聲波—根據(jù)探測的信號完成圖像重建。

目前，國內(nèi)外針對光聲成像技術(shù)開展的研究正處于快速發(fā)展階段，主要分為以下3個(gè)方向：光聲顯微成像（Photoacoustic microscopy，PAM）、光聲計(jì)算層析成像（Photoacoustic computed tomography，PACT）、光聲內(nèi)窺成像（Photoacoustic endoscopy，PAE），每個(gè)研究方向又衍生出不同的研究分支[2,3]。其中，PAM可實(shí)現(xiàn)亞微米至亞毫米級的空間分辨率，成像深度達(dá)百微米至數(shù)毫米，和依賴于重建算法的PACT相比，PAM僅依靠逐點(diǎn)光柵掃描的方式來獲取光聲信號，無需復(fù)雜算法即可完成圖像重建，且PAM能夠?qū)崿F(xiàn)活體結(jié)構(gòu)、分子與功能的多參量高分辨成像，故成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文首先按不同的結(jié)構(gòu)形式對PAM技術(shù)進(jìn)行了分類，并回顧其發(fā)展起源；其次，重點(diǎn)闡述了新型PAM技術(shù)的研究進(jìn)展，主要包括PAM的新型掃描方法和手持式PAM設(shè)備的研究進(jìn)展；再次，針對PAM技術(shù)焦深（Depth of focus,DoF）受限的問題，分析了PAM的DoF延拓的新技術(shù)；然后，從多角度展示了PAM技術(shù)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究；最后，總結(jié)了PAM技術(shù)發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)，并展望了PAM技術(shù)未來的發(fā)展方向。

1 PAM技術(shù)的分類及其起源

PAM是一種聚焦型掃描成像技術(shù)，根據(jù)激發(fā)光和超聲探測聚焦方式的不同，可以分為光學(xué)分辨率PAM（Optical-resolution PAM，OR-PAM）和聲學(xué)分辨率PAM（Acoustic-resolution PAM，AR-PAM）[4]，二者聚焦方式如圖1所示，其中，OR-PAM的光學(xué)聚焦比聲學(xué)聚焦更加緊密，光學(xué)焦點(diǎn)比聲探測焦點(diǎn)小，如圖1（a）所示，其橫向分辨率取決于光學(xué)焦點(diǎn)的大小，可以達(dá)到從百納米到數(shù)微米的亞細(xì)胞或細(xì)胞尺度，但是受光在生物組織中的散射限制，活體成像深度1～2 mm。在超過光學(xué)擴(kuò)散極限的幾毫米甚至幾十毫米深的組織處，AR-PAM則可以利用超聲的低散射特性，采用更加緊密的聲學(xué)聚焦方式，實(shí)現(xiàn)從幾十微米到幾百微米的橫向分辨率，此時(shí)，橫向分辨率取決于超聲焦點(diǎn)的大小，如圖1（b）所示。

圖1 PAM聚焦方式對比Fig.1 Comparison of focusing modes of PAM

目前，常見的PAM實(shí)現(xiàn)形式如圖2所示，為了最大化成像系統(tǒng)的探測靈敏度，通常將激發(fā)光和超聲探測共軸共焦設(shè)置[5]。圖2（a,b）分別為典型的透射式和反射式ORPAM，透射式OR-PAM利用較高數(shù)值孔徑（Numerical aperture,NA）的物鏡將激光光斑聚焦到衍射極限，可以實(shí)現(xiàn)亞微米級分辨率，但是，值得注意的是其工作距離也會隨著物鏡NA增大而減小，如聚焦物鏡NA為1.2時(shí)，工作距離僅有約200 μm，且聚焦物鏡和超聲換能器置于樣本兩側(cè)的結(jié)構(gòu)形式，使其只能對厚度較薄的樣品成像，而反射式ORPAM使用光聲耦合棱鏡將換能器和光聚焦物鏡配置在同側(cè)來實(shí)現(xiàn)光聲共軸共焦，利用稍低NA的物鏡進(jìn)行光學(xué)聚焦可延長其工作距離，分辨率仍能到微米級，應(yīng)用范圍更加靈活。圖2（c）為暗場照明的AR-PAM，激光透過錐透鏡后呈環(huán)形，經(jīng)過聚光鏡反射后在樣本表面弱聚焦，高頻超聲換能器進(jìn)行更緊密的聲學(xué)聚焦，該結(jié)構(gòu)形式可提高顯微成像的深度。

圖2 常見PAM形式[5]Fig.2 Representative implementations of PAM[5]

2005年，美國圣路易斯華盛頓大學(xué)的Wang教授[6]課題組利用暗場激光照明和高頻超聲探測設(shè)計(jì)了最早的光聲顯微鏡，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了小鼠皮下血管的無創(chuàng)成像，橫向分辨率達(dá)到45 μm，成像深度大于 3 mm，屬于AR-PAM，如圖3（a）所示。2008年，該課題組在AR-PAM基礎(chǔ)上通過光學(xué)強(qiáng)聚焦的方式開發(fā)出第1代OR-PAM[7]，其光聲耦合方式如圖3（b）實(shí)線框中所示，光聲耦合棱鏡由兩個(gè)直角石英棱鏡組成，其間填充與石英光學(xué)折射率接近但聲阻抗相差較大的硅酮油，用作透光反聲，超聲信號由側(cè)面放置的換能器完成探測。雖然該系統(tǒng)分辨率達(dá)到5 μm，成像深度大于0.7 mm，實(shí)現(xiàn)了小鼠微血管的活體成像，但是系統(tǒng)靈敏度依然不高，究其原因是超聲波的反射使大部分縱波轉(zhuǎn)換為橫波，而換能器對橫波探測靈敏度較低。因此，該課題組的Hu等[8]對光聲耦合棱鏡進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)，如圖3（b）虛線框所示，將其中一個(gè)直角棱鏡替換成菱形棱鏡，使超聲在空氣-玻璃界面重新由橫波轉(zhuǎn)換為縱波，相比第1代系統(tǒng)，成像靈敏度提高了約18.4 dB。

2 新型PAM技術(shù)的研究進(jìn)展

PAM技術(shù)憑借高性能的空間分辨率和特有的高光學(xué)對比度受到越來越多生物醫(yī)學(xué)研究者的青睞，經(jīng)過十余年的發(fā)展，在國內(nèi)外眾多研究小組的共同努力下，PAM技術(shù)已經(jīng)在探測靈敏度、成像分辨率和成像速度等方面取得了長足進(jìn)步。為了解決傳統(tǒng)電機(jī)機(jī)械掃描方式成像速度受限的問題，各種新型掃描方法的PAM相繼問世；為了使系統(tǒng)形式更加緊湊、便攜，小型化的手持式PAM系統(tǒng)成為了另一熱門研究方向。下文將重點(diǎn)介紹新型PAM掃描方法和手持式PAM系統(tǒng)的研究進(jìn)展。

2.1 新型PAM掃描方法

成像速度的提升對高動態(tài)、時(shí)間敏感的生物學(xué)現(xiàn)象研究至關(guān)重要，如何在不犧牲成像靈敏度和成像視場的情況下提高PAM速度，成為眾多研究者思索的一大問題。近年來，針對掃描速度提升，各種新型掃描方法的PAM相繼被研發(fā)。

Zhang等[9]提出了一種基于掃描振鏡的PAM來提高成像速度，如圖4（a）所示。成像過程中，超聲換能器保持固定，通過檢流計(jì)驅(qū)動的二維掃描振鏡反射激光在樣本表面掃描，使用重復(fù)頻率為1024 Hz激光掃描一個(gè)256像素×256像素大小的區(qū)域耗時(shí)不超過2 min。該系統(tǒng)的缺點(diǎn)是成像視場取決于非聚焦型超聲換能器探測范圍的大小，受到一定限制，并且視場內(nèi)探測靈敏度分布不均勻，有效視場直徑為6 mm。隨后Rao等[10]將檢流計(jì)驅(qū)動的掃描振鏡作為掃描快軸，電機(jī)機(jī)械軸作為掃描慢軸，同時(shí)采用線聚焦型換能器，改進(jìn)提出一種混合掃描方式的PAM，如圖4（b）所示，一定程度上解決了成像視場較小的問題，成像信噪比也得到了提高。

Song等[11]采用微透鏡陣列聚焦激光，陣列式換能器探測超聲的方式首次提出了一種透射式多焦點(diǎn)掃描模式的PAM，如圖5（a）所示，與傳統(tǒng)逐點(diǎn)掃描方法相比，較大提高了掃描速度，1000像素×500像素×200像素的體數(shù)據(jù)掃描時(shí)間不超過4 min，分辨率可達(dá)到10 μm。為了突破透射式對成像樣品厚度的局限，Li等[12]在此基礎(chǔ)上，采用陣列式微型反射棱鏡，開發(fā)出反射式多焦點(diǎn)PAM，如圖5（b）所示，系統(tǒng)橫向分辨率達(dá)到16 μm，掃描6 mm×5 mm×2.5 mm大小的區(qū)域用時(shí)不超過2.5 min。

Wang等[13]將PAM掃描探頭集成到高速音圈線性平移臺（Voice-coil stage）上，在1 mm掃描范圍實(shí)現(xiàn)最快40幀/s的B-scan掃描速度，其橫向分辨率達(dá)到3.4 μm，高分辨率的快速掃描性能，使其在血流速度和血氧飽和度等高動態(tài)過程的實(shí)時(shí)成像方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖6所示，其掃描速度一定程度受到探頭的重量和激光重復(fù)頻率限制。

圖3 Wang課題組早期設(shè)計(jì)的PAM系統(tǒng)圖[6,7]Fig.3 Early design of PAM system diagram of Wang’s research group[6,7]

圖4 基于掃描振鏡的PAM系統(tǒng)[9,10]Fig.4 PAM systems based on galvo mirrors[9,10]

為了進(jìn)一步提升PAM的成像速度和靈敏度，Yao等[14]采用水浸式微機(jī)電系統(tǒng)（Micro-electro-mechanical system,MEMS）振鏡作為掃描快軸，機(jī)械電機(jī)作為掃描慢軸，開發(fā)出一種高靈敏度寬視場快速掃描PAM系統(tǒng)，如圖7所示。成像過程中，水浸式MEMS振鏡可以同時(shí)反射激光和超聲，使激發(fā)光和超聲探測在較大視場內(nèi)保持共焦性能，保證了視場內(nèi)探測靈敏度的一致性。該系統(tǒng)在3 mm范圍內(nèi)的線掃描速度達(dá)到400幀/s，相同的掃描范圍下，比Hu提出的第2代機(jī)械掃描系統(tǒng)[8]快了約400倍，比Wang提出的快速音圈掃描系統(tǒng)[13]快了約20倍，極大提升了PAM的成像速度。此后，眾多基于MEMS振鏡的PAM研究工作相繼開展[15-17]。

近期，Lan等[18]首次將多面轉(zhuǎn)鏡（Polygonal scanners）應(yīng)用于 PAM系統(tǒng)，提出了一種基于六面轉(zhuǎn)鏡的高速寬視場PAM成像系統(tǒng)，系統(tǒng)原理如 圖 8（a）所 示 。多面轉(zhuǎn)鏡由電機(jī)與多面棱鏡組成，多面棱鏡具有多個(gè)反射面，安裝在電動機(jī)的旋轉(zhuǎn)軸上，通過電機(jī)的旋轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)大范圍、超高速、高精度與高重復(fù)性的光束掃描，六面轉(zhuǎn)鏡結(jié)構(gòu)如圖8（b,c）所示。相比MEMS振鏡掃描，多面轉(zhuǎn)鏡具有更快的掃描速度和更高的損傷閾值，12 mm范圍內(nèi)B-scan掃描速率可高達(dá)900 Hz，相同大小區(qū)域下的成像速度比基于MEMS振鏡的PAM[17]快約10倍，比音圈掃描系統(tǒng)[13]快約300倍，比機(jī)械掃描系統(tǒng)[8]快約3900倍，多面轉(zhuǎn)鏡很好地解決了現(xiàn)有PAM系統(tǒng)成像速度慢和視場局限的問題，具備較高的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 多焦點(diǎn)掃描PAM系統(tǒng)[11,12]Fig.5 Multifocus scanning PAM systems[11,12]

圖6 快速音圈掃描PAM[13]Fig.6 Fast voice-coil scanning PAM[13]

2.2 手持式PAM系統(tǒng)

近年來，為了更好地適應(yīng)臨床應(yīng)用需求，PAM系統(tǒng)的小型化、集成化和便攜性成了另外一個(gè)熱門研究方向，和外觀笨重而龐大的傳統(tǒng)臺式成像系統(tǒng)相比，各類裝配緊湊型手持式PAM系統(tǒng)的應(yīng)用更加靈活和方便。其中，以下課題組開發(fā)的手持式PAM具有一定代表性。

美國圣路易斯華盛頓大學(xué)Wang教授課題組的Lin等[19]采用雙軸水浸式MEMS振鏡，使激發(fā)光和超聲通過同一鏡面反射同時(shí)快速掃描，在2.5 mm×2.0 mm×0.5 mm的范圍下獲得2 Hz的三維成像速率，分辨率達(dá)到5 μm。整個(gè)手持系統(tǒng)大小80 mm×115 mm×150 mm，內(nèi)部充滿水用于超聲耦合，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖9所示。

圖7 基于水浸MEMS振鏡的PAM[14]Fig.7 PAM system basedona water-immersible MEMS scanning mirror[14]

韓國浦項(xiàng)科技大學(xué)Kim教授課題組的Park等[20]采用自制的雙軸水浸式MEMS振鏡，將所有的聲學(xué)、光學(xué)和機(jī)械部件集成到直徑為17 mm和質(zhì)量為162 g的探頭中，提出了系統(tǒng)結(jié)構(gòu)更加緊湊的手持式PAM系統(tǒng)，其中光聲耦合方式為透光反聲式，與Lin的反光透聲式系統(tǒng)有所區(qū)別。通過增大驅(qū)動電壓可以增大MEMS機(jī)械轉(zhuǎn)角，最大視場可以達(dá)到4.1 mm×2.9 mm,結(jié)合步進(jìn)電機(jī)移動可以進(jìn)一步擴(kuò)展成像范圍，從實(shí)驗(yàn)方面論證了該系統(tǒng)在檢測人體黑色素瘤等臨床應(yīng)用的潛力，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖10所示。

圖8 基于多面轉(zhuǎn)鏡的PAM[18]Fig.8 PAM system based on polygonal scanners[18]

圖9 Wang課題組的手持式PAM[19]Fig.9 Hand held PAM of Wang’s research group[19]

南方科技大學(xué)的Xi教授課題組在手持式PAM系統(tǒng)的研究也較為深入，2018年，該課題組的Chen等[21]設(shè)計(jì)了一款緊湊型OR-PAM。將非水浸式MEMS振鏡置于光聲棱鏡前端，單獨(dú)用作激光掃描。由于該方案采用聚焦超聲的探測方案無法實(shí)現(xiàn)光、聲焦點(diǎn)的同步共焦，所以設(shè)計(jì)中采用了非聚焦換能器進(jìn)行超聲探測，和基于水浸式MEMS的探測方案相比，非聚焦的超聲探測一定程度上會降低探測靈敏度，但是該設(shè)計(jì)創(chuàng)新性地采用水代替玻璃材質(zhì)作為光聲耦合，減少了橫縱波轉(zhuǎn)換帶來的超聲損失，仍然獲得了較高的探測靈敏度。系統(tǒng)橫向分辨率達(dá)到3.2 μm，2 mm×2 mm范圍成像速度達(dá)到3.2 Hz，具有良好的便攜操作性能，利用該系統(tǒng)在人體口腔各部位血管進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)，獲得了較好的成像效果。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖11所示，整個(gè)探頭約20 g，外形尺寸僅22 mm×30 mm×13 mm。

3 PAM的DoF延拓技術(shù)的研究進(jìn)展

OR-PAM依靠緊密的光學(xué)聚焦可以實(shí)現(xiàn)高分辨率的成像效果，然而，傳統(tǒng)OR-PAM通常依靠高NA的物鏡進(jìn)行激光聚焦，在獲取較高橫向分辨率的同時(shí)會限制成像系統(tǒng)的DoF大小，使得OR-PAM在三維成像和獲取不同深度方向信息方面存在局限，并且，離焦區(qū)域空間分辨率和信噪比的急劇下降也將影響組織形態(tài)結(jié)構(gòu)量化分析的準(zhǔn)確性。為了解決短DoF帶來的問題，通常需要在二維光柵掃描的基礎(chǔ)上，附加多次不同聚焦位置的深度掃描，進(jìn)行三維掃描成像，該方法耗時(shí)較長；輪廓掃描成像[22]是另一種解決方案，首先根據(jù)粗略掃描擬合出興趣目標(biāo)深度方向的輪廓，然后將輪廓曲面作為正式掃描時(shí)深度方向的參考，由外部軟件控制電機(jī)沿深度方向運(yùn)動的軌跡，本質(zhì)上是簡化的三維掃描成像；另外，對于厚度較薄樣本，采取樣本上下兩側(cè)雙激發(fā)光照明[23]的成像方式也能一定程度擴(kuò)展顯微成像DoF。當(dāng)前2種新PAM的DoF延拓技術(shù)分別為：基于貝塞爾光束的PAM和基于變焦透鏡的PAM。

3.1 基于貝塞爾光束的PAM

Durnin等[24,25]于1987年提出了一種無衍射光束——貝塞爾（Bessel）光束，隨后在光學(xué)界引起研究熱潮。和光聲成像中常用的高斯光束相比，無衍射的貝塞爾光束中心光斑的大小和光強(qiáng)可以在某一距離范圍內(nèi)基本保持不變，目前，已經(jīng)在多種光學(xué)成像模式中開展應(yīng)用，如光學(xué)相干層析成像（Optical coherence tomography,OCT）和雙光子熒光顯 微 成 像（Two-photon fluorescence,TPF）等[26-28]。近年來，一些課題組嘗試將貝塞爾光束用于PAM以拓展其成像DoF，提高焦區(qū)外成像分辨率。Jiang等[29]通過軸棱鏡（AX）和環(huán)形掩模（AM）產(chǎn)生貝塞爾光束，提出了一種反射式貝塞爾光束PAM系統(tǒng)（BB-PAM），并且將盲解卷積技術(shù)用于抑制貝塞爾光束旁瓣造成的成像偽影，提高分辨率。BB-PAM系統(tǒng)原理如圖12（a）所示，橫向分辨率達(dá)到1.6 μm，成像DoF達(dá)483 μm，是基于傳統(tǒng)高斯光束PAM系統(tǒng)（GB-PAM）的7倍左右，對開顱小鼠腦血管成像結(jié)果如圖12（b—d），分別為GB-PAM、BB-PAM和盲解卷積處理后的BB-PAM圖像結(jié)果。

圖10 Kim課題組手持式PAM[20]Fig.10 Hand held PAM of Kim’s research group[20]

圖11 Xi課題組手持式PAM[21]Fig.11 Hand held PAM of Xi’s research group[21]

同樣，為了減小貝塞爾光束旁瓣對PAM效果的影響，Shi等[30]基于熱力學(xué)中的Grueneisen弛豫效應(yīng)，在透射式PAM系統(tǒng)中使用連續(xù)激光作為加熱光源，納秒脈沖激光作為成像光源，利用加熱后光聲信號非線性增強(qiáng)的效應(yīng)，對加熱前后的成像結(jié)果進(jìn)行差分，有效抑制了貝塞爾光束旁瓣造成的偽影信號，成功將透射式PAM的DoF拓展到約1 mm，此時(shí)橫向分辨率約7 μm。近期，Park等[31]采用高NA（NA=1.0）的聚焦物鏡和微型超聲換能器，提出了一種貝塞爾光束和高斯光束成像模式自由切換的反射式PAM系統(tǒng)，貝塞爾光束成像模式下可實(shí)現(xiàn)亞波長級分辨率（300 nm），DoF達(dá)229 μm，是高斯光束成像模式下的7倍，成像過程同樣采用盲解卷積算法來減小貝塞爾光束旁瓣的偽影。

3.2 基于變焦透鏡的PAM

電動位移臺驅(qū)動的深度掃描雖然可以在一定程度彌補(bǔ)傳統(tǒng)PAM的DoF不足，但是三維成像速度受限。近年來，同樣為了提升PAM的DoF，一些課題組提出將快速變焦透鏡用于PAM的變焦點(diǎn)掃描，其較快的響應(yīng)速度、較長而連續(xù)的變焦范圍為PAM的DoF延拓提供了另一種有效的方法。

圖12 反射式貝塞爾光束PAM系統(tǒng)和腦血管成像結(jié)果[29]Fig.12 Reflection-mode Bessel-beam PAM and imaging results of cerebral vasculature[29]

Li等[32]將電動變焦透鏡（ETL）用于PAM系統(tǒng)，通過電動變焦透鏡快速連續(xù)調(diào)節(jié)聚焦激光束的擴(kuò)張角，使激光透過平場顯微物鏡（POL）后實(shí)現(xiàn)不同深度的聚焦。系統(tǒng)原理圖如圖13（a）所示，圖13（b）為變焦過程示意圖，采用NA=0.3的平場物鏡可以實(shí)現(xiàn)1 μm的變焦點(diǎn)調(diào)節(jié)精度，調(diào)節(jié)范圍可達(dá)2.82 mm，小鼠耳部和腦部血管活體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了該方法用于深度掃描的可行性。該方法不足之處在于電動變焦響應(yīng)時(shí)間還不夠快，10 μm變焦距離耗時(shí)約15 ms，當(dāng)采用較高重復(fù)頻率激光（＞1000 Hz）作為激發(fā)光源時(shí)，變焦速度有待進(jìn)一步提高。

為實(shí)現(xiàn)PAM更加快速的變焦掃描，拓展成像DoF，Yang等[33,34]將一種可調(diào)諧聲學(xué)梯度（TAG）指數(shù)透鏡用于PAM。TAG透鏡是由充滿折射液體的圓柱形壓電腔體構(gòu)成，通過壓電驅(qū)動器產(chǎn)生超聲波來改變液體的密度和折射率，達(dá)到高速變焦的目的，穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下，變焦時(shí)間在1 μs以內(nèi)[35,36]。系統(tǒng)原理如圖14（a）所示，通過一定長度光纖將單個(gè)激光脈沖延時(shí)獲取3個(gè)間隔120 ns的激光脈沖序列，結(jié)合TAG透鏡的變焦點(diǎn)掃描，可以獲取同一位置處3個(gè)不同聚DoF度處信號，成像系統(tǒng)DoF達(dá)到360 μm，較之前提高了大約3倍，圖14（b,c）分別為TAG透鏡開啟和關(guān)閉時(shí)小鼠腦血管的成像結(jié)果，虛線框處可以看出TAG透鏡對成像DoF的提高效果顯著。

4 PAM技術(shù)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

PAM技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。首先，依靠血紅蛋白作為內(nèi)源性對比劑，可以對生物微血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行高分辨成像，實(shí)現(xiàn)腫瘤等以血管變化為病理特征疾病的連續(xù)無標(biāo)記監(jiān)測；然后，PAM可結(jié)合光聲光譜技術(shù)，對血氧飽和度、血流速度、氧代謝率等生理參數(shù)進(jìn)行多參量光聲功能成像；最后，結(jié)合高特異性的外源性對比劑進(jìn)行高靈敏度分子成像，可彌補(bǔ)組織內(nèi)源性對比劑在疾病診斷或生物過程示蹤中特異性不足的問題。下文將從血管生物學(xué)結(jié)構(gòu)成像、多參量功能成像和外源性分子成像3個(gè)應(yīng)用方向介紹PAM技術(shù)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展。

圖13 采用電動可調(diào)透鏡的快速變焦PAM[32]Fig.13 Fast variable focus PAM using an electrically tunable lens[32]

圖14 采用TAG透鏡的多焦點(diǎn)PAM[33]Fig.14 Multifocus PAM using TAG lens[33]

4.1 血管生物學(xué)結(jié)構(gòu)成像

生物組織中微血管的直徑范圍一般在2～100 μm[37]，是負(fù)責(zé)氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物交換的通道，微血管結(jié)構(gòu)成像可以為眾多疾病的診斷提供生理和病理信息，如糖尿病、尿毒癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[38]。PAM可以實(shí)現(xiàn)微血管結(jié)構(gòu)的非侵入性成像，如圖15所示為OR-PAM用于血管生物學(xué)結(jié)構(gòu)高分辨成像的結(jié)果，微米級的分辨率使其在微血管結(jié)構(gòu)成像中具有獨(dú)特優(yōu)勢。小鼠耳部毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)豐富，且厚度較?。s300 μm）,是用于腫瘤血管生成和其它微血管疾病研究的理想模型[39]，Hu等[8]基于PAM技術(shù)率先實(shí)現(xiàn)了小鼠耳部微血管的成像（圖15（a））；Li等[40]通過PAM技術(shù)首次獲取了貓腦初級視覺皮層的完整微血管網(wǎng)絡(luò)（圖15（b）），結(jié)合創(chuàng)新性血管提取算法為神經(jīng)血管偶聯(lián)及腦疾病的應(yīng)用研究提供了新的方法；Zhao等[41]結(jié)合三維Hessian矩陣血管增強(qiáng)算法實(shí)現(xiàn)了大鼠虹膜血管結(jié)構(gòu)的高精度提取（圖15（c）），與此同時(shí)，Zhao等[42]還提出一種創(chuàng)新的運(yùn)動校正算法，對活體PAM過程中的運(yùn)動偽影進(jìn)行校正，實(shí)現(xiàn)了高精度圖像配準(zhǔn)，首次獲取了小鼠背部微血管結(jié)構(gòu)的大視場光聲顯微圖像（圖15（d））。此外，PAM還被廣泛用于小鼠穴位微循環(huán)[43]、大鼠腸系[44]、人體皮膚[45]和口腔[46]等組織的血管生物學(xué)結(jié)構(gòu)的成像研究，正在成為生命科學(xué)研究和臨床應(yīng)用中一項(xiàng)重要的新型成像技術(shù)。

圖15 OR-PAM的血管生物學(xué)結(jié)構(gòu)成像結(jié)果[8,40-42]Fig.15 OR-PAM imaging of vascular biological structure[8,40-42]

由于PAM技術(shù)出色的微血管結(jié)構(gòu)成像性能，使腫瘤等以微血管變化為病理特征疾病的無標(biāo)記監(jiān)測成為可能。近年來，涌現(xiàn)出大量利用PAM技術(shù)進(jìn)行腫瘤診斷和監(jiān)測的應(yīng)用研究[47-51]，Jin等[52]通 過 手 持 式PAM系統(tǒng)對LS174T癌細(xì)胞腫瘤的微血管生成過程進(jìn)行了連續(xù)多天監(jiān)測，如圖16所示，隨著腫瘤的生長，新生血管不斷生成，其形成開始于腫瘤的邊界，并隨著血管密度的增加逐漸向腫瘤中心擴(kuò)散。由于口腔內(nèi)存在著高密度的血管網(wǎng)絡(luò)，其結(jié)構(gòu)的改變與口腔的早期癌變密切相關(guān)，Jin等還通過對人體嘴唇和舌頭部位血管成像，進(jìn)一步證明了該顯微成像系統(tǒng)臨床應(yīng)用的可能性。

圖16 腫瘤血管生成的PAM監(jiān)測[52]Fig.16 In vivo PAM monitoring of mouse LS174T tumor angiogenesis[52]

4.2 多參量功能成像

光聲信號的產(chǎn)生是基于樣本中光吸收物質(zhì)對光能量的吸收，生物組織中不同物質(zhì)成分存在不同的光吸收譜，即不同的物質(zhì)成分對不同波長的光吸收強(qiáng)度有所區(qū)別[23]，圖17所示為生物組織中常見內(nèi)源性分子的光吸收譜[53]。根據(jù)物質(zhì)的吸收譜，采用多波長激發(fā)光的多光譜PAM技術(shù)可以解析出特定目標(biāo)成分的相對含量[54]，以此來獲取生物組織結(jié)構(gòu)信息以外的多參量生理功能信息，如通過解析含氧血紅蛋白（HbO2）和脫氧血紅蛋白（HbR）在血液中的相對含量可以計(jì)算血氧飽和度（sO2）。

Zhang等[55,56]首次提出了光聲功能顯微成像（fPAM）的概念，基于AR-PAM系統(tǒng)，采用578、584、590和596 nm 4個(gè)波長對小鼠背部皮下血管進(jìn)行血氧飽和度功能成像，在微血管水平上實(shí)現(xiàn)了高氧、常氧和缺氧狀態(tài)下血氧飽和度變化的測量，此后，眾多PAM測量血氧飽和度的研究被報(bào)道[57-60]。由于多數(shù)疾病的發(fā)生都會對血液流動產(chǎn)生不良影響，破壞細(xì)胞正常的氧代謝活動，結(jié)合血流速度測量則可進(jìn)一步獲取組織的氧代謝率（MRO2）功能參數(shù)。Yao等[61]在此基礎(chǔ)上提出基于電機(jī)雙向掃描的光聲多普勒頻帶展寬血液流速測量方法，實(shí)現(xiàn)了小鼠膠質(zhì)瘤血氧飽和度和氧代謝率的監(jiān)測，如圖18所示，圖18（a）為耳部血氧飽和度測量結(jié)果；圖18（b）為血流速度測量結(jié)果，紅色箭頭所示為正向；圖18（c）為小鼠耳部膠質(zhì)瘤生長第7天的光聲顯微圖像；圖18（d）結(jié)果表明腫瘤具有高代謝特征，第7天的氧代謝率較第0天增加了1倍；并且，腫瘤內(nèi)部的平均血氧飽和度水平高于腫瘤外部，如圖18（e）所示。

圖17 生物組織中主要內(nèi)源性對比劑的吸收譜[53]Fig.17 Absorption spectra of major endogenous contrast agents in biological tissue[53]

圖18 無標(biāo)記活體氧代謝PAM[61]Fig.18 Label-free oxygen-metabolic PAM in vivo[61]

此外，腦功能成像對于神經(jīng)科學(xué)研究和包括阿爾茲海默癥、抑郁癥、癲癇等腦疾病的研究至關(guān)重要[62-64]，是多參量光聲顯微功能成像的另一個(gè)熱門應(yīng)用方向。傳統(tǒng)成像技術(shù)中，正電子發(fā)射層析成像（PET）能夠量化腦氧代謝率絕對值，但空間分辨率較差[65]；激光散斑成像只能在介觀水平上定性測量腦氧代謝[66]；功能超聲成像能夠?qū)X動物全腦血流進(jìn)行高分辨率成像，但無法獲取血氧飽和度的功能信息[67]。PAM能夠解決以上弊端，在同一時(shí)空尺度下測量腦血紅蛋白質(zhì)量濃度（CHb）、血氧飽和度（sO2）和腦血流速度（CBF），進(jìn)而獲取微觀尺度下的腦氧代謝率（CMRO2）[68]，如圖19所示。

同時(shí)，結(jié)合高時(shí)間和空間分辨率的PAM還可以從細(xì)胞水平研究腦功能變化。Wang等[69]采用雙激發(fā)波長（532和560 nm）快速掃描（20 Hz），實(shí)現(xiàn)了小鼠腦血管單個(gè)紅細(xì)胞的氧釋放速率的測量，圖20（a，b）分別為腦血管血氧飽和度結(jié)果和單個(gè)紅細(xì)胞的氧釋放過程。該研究對于理解大腦神經(jīng)活動和氧代謝之間的聯(lián)系，從細(xì)胞水平揭示大腦的工作機(jī)制具有重大意義。

圖19 多參量小鼠腦功能PAM[61]Fig.19 Multi-parametric functional PAM of mouse brain[61]

圖20 腦血管單細(xì)胞氧代謝率PAM[69]Fig.20 Single cell oxygen metabolism PAM ofcerebral vessels[69]

4.3 外源性分子成像

雖然PAM具有無標(biāo)記和高分辨的成像性能，但是生物內(nèi)源性對比劑在腫瘤細(xì)胞受體的表達(dá)等生物過程的示蹤上特異性不足，因此，大量外源性對比劑被開發(fā)用于提高PAM的特異性和靈敏度[70,71]。外源性對比劑有以下兩方面優(yōu)勢，首先，可以通過特殊的設(shè)計(jì)來提升其化學(xué)和光學(xué)吸收特性，從而提高光聲探測的靈敏度；其次，可以修飾不同的靶向分子（如抗體），使其具有與疾病特異性細(xì)胞表面受體選擇性結(jié)合性能，實(shí)現(xiàn)特定標(biāo)靶的分子成像。目前，基于PAM技術(shù)的外源性分子成像已被應(yīng)用于腫瘤和炎癥等生理病理過程研究。

金納米籠（AuNCs）被認(rèn)為是一種有效的光聲分子成像對比劑，Kim等[72]開展了主動靶向和被動靶向的金納米籠對B16黑色素瘤光聲增強(qiáng)的量化研究。如圖21所示為金納米籠偶聯(lián)[Nle4,D-Phe7]-α-黑素細(xì)胞刺激素的分子探針主動靶向黑色素瘤的PAM結(jié)果，其中利用570 nm波長激光用于微血管顯微成像，778 nm波長激光用于金納米籠探針成像，結(jié)果顯示黑色素瘤的光聲信號隨時(shí)間遞增，6 h達(dá)到最強(qiáng)，主動靶向黑色素瘤的分子探針為黑色素瘤的特異性PAM提供了較高的對比度，為腫瘤診療研究提供了便利。

近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，不同類型的納米材料，如半導(dǎo)體聚合物納米顆粒[73-75]、碳納米管[76,77]和二硫化鉬納米片[78,79]等作為探針被用于PAM特異性和靈敏度增強(qiáng)。Chen等[79]首次開發(fā)了基于層數(shù)依賴的具有光聲放大效應(yīng)的二硫化鉬（MoS2）納米片，用于大深度原位腦膠質(zhì)瘤的精準(zhǔn)PAM，如圖22所示為單層二硫化鉬納米片作為對比劑的原位腦膠質(zhì)瘤成像結(jié)果，小鼠全腦光聲顯微圖像中可以清楚地觀察到位于顱骨以下約1.5 mm深處腫瘤，在注射探針24 h后，腫瘤區(qū)信號約為注射前的36倍，增強(qiáng)效果顯著。借助于功能化納米材料的獨(dú)特優(yōu)勢，外源性分子成像已在腦膠質(zhì)瘤等腫瘤精準(zhǔn)診療中顯示出巨大優(yōu)勢。

圖21 主動靶向B16黑色素瘤的金納米籠分子成像[72]Fig.21 Molecular imaging of B16 melanoma targeted by bioconjugate gold nanocages[72]

5 總結(jié)與展望

經(jīng)過10余年的發(fā)展，PAM已成為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床研究中重要的影像學(xué)手段，本文從原理及分類、新型技術(shù)的發(fā)展和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用等方面介紹了PAM技術(shù)的研究進(jìn)展。結(jié)合各種新型掃描方法，PAM速度得以突破傳統(tǒng)電機(jī)掃描速度限制，在高動態(tài)的生物過程成像上具有應(yīng)用潛力，同時(shí)，小型化和輕量化光聲顯微系統(tǒng)的研制可滿足臨床應(yīng)用需求；針對PAM的DoF限制，基于貝塞爾光束和變焦透鏡的DoF延拓技術(shù)在獲取大DoF三維信息方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，PAM依靠組織內(nèi)源性對比劑可以實(shí)現(xiàn)血管生物學(xué)結(jié)構(gòu)高分辨成像，用于腫瘤血管生成等疾病的無標(biāo)記監(jiān)測和診斷；結(jié)合功能成像，還可以為腫瘤代謝和腦科學(xué)研究提供多參量信息；基于外源性對比劑的分子成像可以對腫瘤等疾病進(jìn)行高靈敏度、高特異性成像，為腫瘤診療研究提供便利。

雖然PAM依靠高分辨的成像性能以及靈活的成像模式，在血管生物學(xué)結(jié)構(gòu)成像、光聲分子與功能成像中廣泛應(yīng)用，但是仍有諸多不足之處有待解決。傳統(tǒng)PAM采用光學(xué)聚焦或者聲學(xué)聚焦的方式難以在單一系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)從微觀到宏觀的跨尺度成像，因此多尺度成像分辨率和成像深度的整合是未來發(fā)展的方向；另外，單一模態(tài)的PAM方式難以勝任復(fù)雜的臨床應(yīng)用實(shí)際需求，多種成像模式的集成化成為另一種新的發(fā)展趨勢，如光聲/超聲成像、光聲/熒光共聚焦成像、光聲/OCT成像等雙模態(tài)或多模態(tài)的成像形式，能夠?yàn)樘囟ǖ膽?yīng)用研究開展提供便利；最后，光聲分子成像則有助于疾病的精準(zhǔn)診斷，而目前可用于光聲成像的分子探針仍然有限，開發(fā)新型光聲成像/治療一體化的外源性分子探針，可為腫瘤等疾病的診療一體化提供新的思路。

圖22 原位腦瘤模型的單層二硫化鉬分子成像[79]Fig.22 Molecular imaging of single-layer MoS2in an orthotopic brain tumor model[79]