珍珠龍膽石斑魚腸道枯草芽孢桿菌的分離鑒定及產(chǎn)酶能力分析

王成強，王際英，黃炳山，李寶山

(山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東 煙臺 264006)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境日益惡化，病害頻發(fā)，同時抗菌藥物的限用，“無抗”生態(tài)化養(yǎng)殖勢在必行，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨非常嚴峻的考驗。為此，眾多學(xué)者致力于各種抗菌藥物替代品的研究，益生菌(乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌等制劑)因具有安全性高、促進動物生長、提高機體免疫能力以及改善水質(zhì)等優(yōu)點，成為了近年來的研究熱點[1-2]。2003年我國農(nóng)業(yè)部公布了能夠用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌種，包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等?？莶菅挎邨U菌是一種短桿狀、無莢膜、能運動的革蘭氏陽性細菌，能產(chǎn)中生芽孢，廣泛分布于土壤、湖泊、海洋、動植物體表及其棲息地。一系列研究均表明[3-5]，飼料中添加枯草芽孢桿菌能夠改善動物消化道內(nèi)環(huán)境、促進動物生長、提高動物機體免疫力及產(chǎn)生多種酶類、提高消化酶活性等，因此枯草芽孢桿菌具有廣闊的發(fā)展前景。

本研究擬從健康的珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀ ×Epinepheluslanceolatus♂)腸道中分離原籍芽孢桿菌，確保了菌株能更加容易地適應(yīng)珍珠龍膽石斑魚腸道的環(huán)境，有利于芽孢桿菌在腸道中存活和繁殖，發(fā)揮菌株的益生性，并對其產(chǎn)酶能力進行分析，旨在篩選出性能穩(wěn)定、益生性好的菌株，為以后研究石斑魚益生菌飼料添加劑和發(fā)酵飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品處理

選取體重為300 g左右，健康、活力好的珍珠龍膽石斑魚。參考賀國龍等[6]方法進行，并稍作修改，首先將石斑魚用丁香酚(1∶10 000)(上海試劑，中國)進行麻醉，之后用75%酒精棉球消毒魚體表，打開腹腔，再用酒精棉球拭擦腸管外壁，并用無菌水沖洗數(shù)遍后，小心取出腸道組織，放置于50 mL無菌離心管中，剪碎勻漿，制成原液，將原液置于70℃恒溫水浴鍋中水浴30 min。

1.1.2 培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂、蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基和纖維素酶培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術(shù)公司。

常規(guī)方法制備營養(yǎng)瓊脂平板，置于37℃恒溫箱16～24 h備用。

1.2 細菌的分離與方法

參照賀國龍等[6]操作方法：將高溫處理后的原液做適量的稀釋后涂布于瓊脂平板上，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑選瓊脂平板上單個灰白色，邊緣不規(guī)則、不整齊、表面粗糙而且干燥的菌落進行純化培養(yǎng)，并在制作成斜面后做進一步的鑒定。

1.3 細菌的生理生化鑒定

細菌的生理生化鑒定參考東秀珠等[7]的方法。

1.4 細菌的16S rDNA鑒定

將斜面保存的菌株送至上海生工生物工程股份有限公司進行菌種鑒定?；痉椒ǎ菏紫忍崛〖毦蚪MDNA，以基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物(7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)，PCR擴增所篩選出菌株的16S rDNA，PCR長度為1 500 bp左右。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。之后進行測序處理。

1.5 細菌菌屬的確定

根據(jù)測定的基因序列，通過NCBI/BLAST/blastn軟件(http：//blast.Bcbi.Nlm.Nih.gov)，在NCBI的數(shù)據(jù)庫中查找同源序列，進行同源性比較，確定待測菌種的種屬分類。根據(jù)Fox等[8]研究表明，同源性大于99%的細菌判定為同種細菌；同源性介于95%～99%判定為同屬；同源性在91%～95%判定為同科。

1.6 產(chǎn)酶能力分析

采用平板透明圈法，將已鑒定的菌株接種于牛肉蛋白胨培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)(37℃、160 r/min、10 h)，調(diào)整菌液濃度，使之達到1×108cfu/mL，用濾紙沾取菌液，分別點種于蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶的選擇培養(yǎng)基平板上，每種處理設(shè)3個重復(fù)，37℃培養(yǎng)24 h，觀察平板上有無水解圈及其大小，以水解圈直徑/菌落直徑的比值為指標表征產(chǎn)酶能力的大小[9]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用平均值±標準誤差(Mean±SD)來表示所得試驗數(shù)據(jù)，另外用Tukey’s檢驗方法對試驗數(shù)據(jù)進行多重比較，當(dāng)P<0.05時表示結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)結(jié)果

在珍珠龍膽石斑魚腸道中篩選到4株疑似枯草芽孢桿菌的菌落，分別記做B1、B2、B3、B4，將4株菌分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18 h后，觀察形成的菌落形態(tài)(圖1)。B1：菌落表面干燥、褶皺、扁平、不透明、乳白色、邊緣不整齊、直徑2～5 mm的中大菌落；B2：菌落呈灰白色、無光澤，表面粗糙，菌落邊緣不整齊，為干燥型菌落；B3：菌落呈灰白色、不透明，菌落邊緣鋸齒狀，菌落中間突起，中間像一個圓形的火山口；B4：菌落呈灰白色，不透明，菌落邊緣鋸齒狀，菌落中間突起，有皺褶。

2.2 菌株的生理生化特性

4株菌的生理生化試驗結(jié)果見表1，根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》[10]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]，4株菌的試驗結(jié)果均符合枯草芽孢桿菌的生化特性，初步證明分離菌均為枯草芽孢桿菌。

表1 4株菌的生理生化試驗結(jié)果

注：“+”表示陽性或生長，“-”表示陰性或不生長，“±”表示不明顯。

Note：“+”showed positive or growth，“-”showed negative or no growth，“±”showed no obviousness.

2.3 分離菌株的PCR鑒定結(jié)果

通過上海生工生物工程股份有限公司分析，B1、B2、B3和B4等4株菌的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約1 500 bp處均有特異性條帶出現(xiàn)，條帶單一、明亮(圖2)，證明4株菌可能均為芽孢桿菌屬。

將純化的PCR產(chǎn)物進行序列分析，得到4株菌的16S rDNA序列結(jié)果。同時，在NCBI的數(shù)據(jù)庫中查找B1、B2、B3和B4菌株的16S rDNA基因序列的同源序列，將4株菌的16S rDNA與已經(jīng)報道芽孢桿菌屬的序列進行分析比較。結(jié)果顯示，B1菌株的核苷酸序列與BacillussubtilisstrainYS52(KU551251.1)的同源性為99%；B2菌株的核苷酸序列與BacillussubtilisstrainDS62(KU551234.1)的同源性為99%；B3菌株的核苷酸序列與Bacillussubtilisstrain51(KX216383.1)的同源性為100%；B4菌株的核苷酸序列與BacillussubtilisstrainGQJK2(CP020367.1)的同源性為99%。經(jīng)過16S rDNA基因序列比對發(fā)現(xiàn)，4株菌與枯草芽孢桿菌的同源性都達到99%以上，另外，利用DNAMAN 9軟件對4株菌的16S rDNA序列結(jié)果進行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株菌的同源性為96.43%，因此4株菌均被鑒定為枯草芽孢桿菌。4株菌的16S rDNA序列BLAST比對結(jié)果見圖3。

2.4 分離菌株產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的能力

根據(jù)東秀珠等[2]方法，對分離菌株進行了產(chǎn)酶能力試驗，測定了4株菌的水解圈直徑和菌落直徑，以水解圈直徑/菌落直徑為指標，比值越大，則產(chǎn)酶能力越強。由表2可以看出，4株菌都有產(chǎn)纖維素酶的能力，菌株的水解圈直徑大小排序為B3>B2>B4>B1，4株菌的菌落直徑大小無顯著性差異(P>0.05)。B3菌株的水解圈直徑/菌落直徑比值最大，分別比B1、B2和B4大了34.01%、10.33%和24.44%，其中顯著大于B1菌株(P<0.05)，同B2、B4菌株無顯著性差異(P>0.05)。

表2 4株菌產(chǎn)纖維素酶的能力分析

注：表格中同列肩標相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同此。

Notes：In the same row，values with same small letter superscripts or no letter superscripts meant no significant differences(P>0.05)，different small letter superscripts meant significant differences(P<0.05).The same as the following tables.

由表3可以看出4株菌都有產(chǎn)淀粉酶的能力，菌株的水解圈直徑大小排序為B3>B1>B2>B4，菌株的菌落直徑大小排序為B4>B2>B1>B3。菌株的水解圈直徑/菌落直徑的比值大小排序為B3>B1>B2>B4，B3菌株比值顯著大于B2、B4菌株(P<0.05)，同B1菌株比值大小無顯著性差異(P>0.05)。

表3 4株菌產(chǎn)淀粉酶的能力分析

由表4可以看出，4株菌都有產(chǎn)蛋白酶的能力，菌株的水解圈直徑大小排序為B3>B1>B2>B4，菌株的菌落直徑大小排序為B1>B4>B3>B2。菌株的水解圈直徑/菌落直徑的比值大小排序為B2>B3>B1>B4，其中B2和B3菌株比值無顯著性差異(P>0.05)，但顯著大于B1、B4菌株(P<0.05)。

表4 4株菌產(chǎn)蛋白酶的能力分析

3 結(jié)語

本試驗，從珍珠龍膽石斑魚腸道中分離4株菌B1、B2、B3和B4，經(jīng)菌落形態(tài)、生理生化試驗以及16S rDNA序列比對，均鑒定為枯草芽孢桿菌，同時經(jīng)過產(chǎn)酶能力的試驗發(fā)現(xiàn)，4株菌都具有產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的能力，且B3菌株同其他3株菌株相比，其產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的能力都較強。菌株的產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶的能力越強，酶系越全，其飼喂效果越好[11]。因此，本試驗選取B3作為具有益生菌潛力的菌株，用于后續(xù)試驗，預(yù)期將具有較好的飼喂效果和試驗結(jié)果。