胃、腸消化后豬肝醬中鐵和鋅的形態(tài)分析

張建萍，蔡望秋，陳尚龍，陳安徽，李 超

（1.徐州工程學(xué)院 食品（生物）工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實驗室，江蘇 徐州 221018）

Fe和Zn都是人體必需的微量元素[1]，眾所周知，長期缺Fe或Zn對人體健康具有較大的危害[2]。豬肝系列產(chǎn)品中含有豐富的Fe和Zn，之前的研究以測定Fe和Zn總量為主，對其形態(tài)分析較少[3]。相關(guān)研究報告表明[4-7]，人體對微量元素的吸收與其形態(tài)密切相關(guān)，與無機(jī)態(tài)相比，有機(jī)態(tài)的金屬元素更易被人體吸收。近年來，隨著對微量元素研究的深入，已有一些形態(tài)分析研究報道，MEI T等[8]利用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)，金針菇水溶性蛋白中至少含有6種含硒蛋白，約占總可溶性硒的7.0%；李紅衛(wèi)等[9]利用4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯柱前衍生，建立高效液相色譜法測定富硒米曲霉中有機(jī)硒形態(tài)的分析方法，取得了良好的效果。

實驗動物模型可以較好的模擬人體消化和吸收的過程，但其成本高、耗時、耗力。本實驗以實驗室研制的豬肝醬為研究對象，采用體外全仿生消化（含消化酶）技術(shù)[10-13]模擬豬肝醬在胃、腸中消化，依據(jù)化學(xué)仿生（人工胃、腸）與醫(yī)學(xué)仿生（酶的作用）原理，模擬豬肝醬經(jīng)胃腸環(huán)境的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，研究胃、腸所含的無機(jī)物、有機(jī)物及消化酶對豬肝醬中Fe、Zn形態(tài)和生物可給性的影響。利用0.45 μm微孔濾膜分離懸浮態(tài)和可溶態(tài)，通過D101大孔樹脂實現(xiàn)無機(jī)態(tài)和有機(jī)態(tài)的分離。微波消解后使用高分辨-連續(xù)光源原子吸收光譜（high resolution-continuum source atomic absorption spectrometry，HR-CS AAS）儀[14-18]測定各形態(tài)Fe和Zn的含量，為科學(xué)補(bǔ)充Fe和Zn提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肝醬：實驗室研制產(chǎn)品。

粘液素、牛血清白蛋白、黏蛋白、胰液素、淀粉酶、脂肪酶（均為生化試劑）：上海源葉生物科技有限公司；KCl、KSCN、NaH2PO4、Na3PO4、NaCl、NaOH、CaCl2、NH4Cl、NaHCO3、KH2PO4、MgCl2（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ContrAA 700高分辨-連續(xù)光源原子吸收光譜儀（簡稱HR-CS AAS）：德國Analytik Jena公司；XT-9900型智能微波消解儀、XT-9800多用預(yù)處理加熱儀：上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；CascadaTM實驗室超純水系統(tǒng)：美國Pall公司；3-30K臺式高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司；L550臺式低速離心機(jī)：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬肝醬制作工藝流程[19-21]

腌制：將瀝水后的豬肝和五花肉加入香料，滾揉腌制30 min。腌制配比：豬肝100 g，五花肉10 g，料酒3 g，蔥1 g，姜3 g，蒜3 g，白砂糖2 g。

炒制：將20 g植物油和5 g豬油加入鍋中，加熱后加入蒜末和姜末，出味后依次加入五香粉、鹽、味精、淀粉、糊精等進(jìn)行炒制，炒制時間為3 min。

炒制配方：豬肝100 g，五花肉10 g，蒜3.75 g，姜3.75 g，五香粉1 g，鹽3.75 g，味精0.5 g，淀粉3.5 g，糊精7 g，亞硝酸鈉1.2 g，復(fù)合磷酸鹽1 g。

脫氣：將斬拌好的樣品真空滾揉10 min。

殺菌：將灌裝好的豬肝醬121 ℃殺菌60 min。

1.3.2 儀器工作參數(shù)

HR-CS AAS（火焰法）測定Fe和Zn的工作參數(shù)見表1。同時進(jìn)行乙炔流量和燃燒器高度的優(yōu)化。

表1 HR-CS AAS工作參數(shù)Table 1 Working parameters of HR-CS FAAS

1.3.3 樣品前處理及其Fe和Zn的測定

參考文獻(xiàn)[1]，采用微波消解處理豬肝醬及其胃、腸消化后的樣品，根據(jù)Fe和Zn的實際濃度，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，最后再使用HR-CS AAS按表1的工作參數(shù)測定Fe和Zn。

1.3.4 消化液的制備

參考文獻(xiàn)[22]，分別加入唾液、胃液、十二指腸液和膽汁中所含的有機(jī)物和無機(jī)物，利用HCl和NaHCO3調(diào)節(jié)pH值，再用超純水定容至500 mL，置于4 ℃冷藏保存?zhèn)溆?，使用前在此基礎(chǔ)上分別加入相應(yīng)的消化酶。

1.3.5 模擬豬肝醬在胃中消化

在50.0 g豬肝醬中添加5.00 mL唾液，混勻后在37 ℃、60 r/min條件下恒溫振蕩5 min后；再添加75.0 mL胃液，混勻后在37 ℃、60 r/min條件下恒溫振蕩2 h[22]；結(jié)束后將樣品轉(zhuǎn)移至適當(dāng)離心管中，通過離心實現(xiàn)固液分離，稱量上清液（豬肝醬胃全仿生消化液）質(zhì)量。

1.3.6 模擬豬肝醬在腸中消化

在50.0 g豬肝醬中添加5.00 mL唾液，混勻后在37 ℃、60 r/min條件下恒溫振蕩5 min后；添加75.0 mL胃液，混勻后在37 ℃、60 r/min條件下恒溫振蕩2 h；再添加100.0 mL十二指腸液和40.0 mL膽汁，混勻后在37 ℃、60 r/min條件下恒溫振蕩7 h；結(jié)束后將樣品轉(zhuǎn)移至適當(dāng)離心管中，通過離心實現(xiàn)固液分離，稱量上清液（豬肝醬腸全仿生消化液）質(zhì)量。

1.3.7 懸浮態(tài)與可溶態(tài)的分離和測定

將一定質(zhì)量的豬肝醬胃全仿生消化液轉(zhuǎn)移至適當(dāng)離心管中，通過高速離心實現(xiàn)固液分離，再將上清液通過0.45 μm濾膜，懸浮態(tài)將被濾膜截留下來，通過的為可溶態(tài)[1]，并稱其質(zhì)量。再按1.3.3方法對可溶態(tài)樣品進(jìn)行處理和測定。按同樣的方法處理豬肝醬腸全仿生消化液。

懸浮態(tài)Fe（或Zn）=Fe（或Zn）總量-可溶態(tài)Fe（或Zn）

1.3.8 無機(jī)態(tài)與有機(jī)態(tài)的分離和測定

參考文獻(xiàn)[22]，處理D101大孔吸附樹脂，將一定質(zhì)量的可溶態(tài)溶液通過樹脂，用體積分?jǐn)?shù)1%的HNO3按一定流速洗滌樹脂，再按1.3.3方法對洗脫液樣品進(jìn)行處理和測定，洗脫液樣品中Fe和Zn為無機(jī)態(tài)。

有機(jī)態(tài)Fe（或Zn）=可溶態(tài)Fe（或Zn）-無機(jī)態(tài)Fe（或Zn）

1.3.9 Fe（或Zn）生物可給性的計算

模擬豬肝醬在胃、腸中消化，F(xiàn)e（或Zn）生物可給性的計算公式如下：

式中：BA為Fe（或Zn）的生物可給性，%；TK為胃、腸消化液中可溶態(tài)Fe（或Zn）含量，μg/g；TZ為豬肝醬中Fe（或Zn）總量，μg/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定參數(shù)的優(yōu)化

使用HR-CS AAS測定Fe和Zn時，利用儀器自帶優(yōu)化功能對不同測定參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見表2。

由表2可知，HR-CS AAS測定Fe的最佳參數(shù)為乙炔流量80 L/h，燃燒器高度5 mm；測定Zn的最佳參數(shù)為乙炔流量90 L/h，燃燒器高度6 mm。

表2 測定參數(shù)的優(yōu)化Table 2 Optimization of determination parameters

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

使用HR-CS AAS測定不同濃度的Fe標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸光度值以A表示，F(xiàn)e標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度以c表示，經(jīng)儀器自帶軟件繪制，得Fe回歸方程為A1=（-0.001 375 2+0.025 587 4×c1）/（1+0.019 396 3×c1），相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5；同理，得Zn回歸方程為A2=（-0.018 503+0.131 201 5×c2）/（1+0.128 793 8×c2），相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1；Fe和Zn標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的相關(guān)系數(shù)R2均≥0.999，這表明濃度與吸光度值有良好的關(guān)系。

2.3 加標(biāo)回收率

將一定量Fe、Zn標(biāo)準(zhǔn)溶液和豬肝醬樣品一起置于微波消解罐中進(jìn)行微波消解，按1.3.3方法進(jìn)行處理和測定，重復(fù)6次，計算加標(biāo)回收率[23]，結(jié)果見表3。

由表3可知，F(xiàn)e平均加標(biāo)回收率為103.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）=1.28%；Zn平均加標(biāo)回收率為96.8%，RSD=1.58%。這表明按1.3.3方法進(jìn)行處理和測定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表3 加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 3 Results of adding standard recoveries

2.4 消化液中Fe的形態(tài)分析

胃、腸消化后豬肝醬中Fe的形態(tài)分析，結(jié)果見表4。

由表4可知，豬肝醬含有豐富的Fe，達(dá)（112.56±3.13）μg/g；消化前豬肝醬中可溶態(tài)Fe為（9.21±0.40）μg/g，占總量的8.18%，其中有機(jī)態(tài)Fe占總量的1.75%，F(xiàn)e的生物可給性為8.18%；豬肝醬在模擬胃中消化后可溶態(tài)Fe為（21.24±0.52）μg/g，占總量的18.87%，其中有機(jī)態(tài)Fe占總量的8.02%，F(xiàn)e的生物可給性為18.87%；豬肝醬在模擬腸中消化后可溶態(tài)Fe為（29.22±0.76）μg/g，占總量的25.96%，其中有機(jī)態(tài)Fe占總量的13.42%，F(xiàn)e的生物可給性為25.96%。

表4 消化液中Fe的形態(tài)分析Table 4 Speciation analysis of Fe in digestive juice

相比消化前，胃消化后除懸浮態(tài)Fe，其他各形態(tài)Fe的含量都所有增加，生物可給性變大；相比胃消化，腸消化后除懸浮態(tài)Fe，其他各形態(tài)Fe的含量都所有增加，生物可給性變大；這表明胃、腸消化都是將一部分懸浮態(tài)Fe消化成可溶態(tài)Fe，其中以有機(jī)態(tài)Fe為主，有利于人體吸收。

2.5 消化液中Zn的形態(tài)分析

胃、腸消化后豬肝醬中Zn的形態(tài)分析，結(jié)果見表5。

由表5可知，豬肝醬含有豐富的Zn，達(dá)（41.38±1.14）μg/g；消化前豬肝醬中可溶態(tài)Zn為（8.13±0.36）μg/g，占總量的19.65%，其中有機(jī)態(tài)Zn占總量的1.81%，Zn的生物可給性為19.65%；豬肝醬在模擬胃中消化后可溶態(tài)Zn為（12.48±0.32）μg/g，占總量的30.16%，其中有機(jī)態(tài)Zn占總量的7.85%，Zn的生物可給性為30.16%；豬肝醬在模擬腸中消化后可溶態(tài)Zn為（18.48±0.49）μg/g，占總量的44.66%，其中有機(jī)態(tài)Zn占總量的16.09%，Zn的生物可給性為44.66%。

相比消化前，胃消化后除懸浮態(tài)Zn，其他各形態(tài)Zn的含量都所有增加，生物可給性變大；相比胃消化，腸消化后除懸浮態(tài)Zn，其他各形態(tài)Zn的含量都所有增加，生物可給性變大；這表明胃、腸消化都是將一部分懸浮態(tài)Zn消化成可溶態(tài)Zn，其中以有機(jī)態(tài)Zn為主，有利于人體吸收。

表5 消化液中Zn的形態(tài)分析Table 5 Speciation analysis of Zn in digestive juice

3 結(jié)論

通過單因素試驗，確定Fe最佳測定條件：乙炔流量為80 L/h，燃燒器高度為5 mm；Zn最佳測定條件：乙炔流量為90 L/h，燃燒器高度為6 mm。在此條件下，測定豬肝醬中Fe含量為112.56 μg/g，Zn含量為41.38 μg/g。胃、腸消化后除懸浮態(tài)Fe和Zn，其他各形態(tài)Fe和Zn的含量都有所增加，生物可給性變大，這表明胃、腸消化都是將一部分懸浮態(tài)Fe和Zn消化成可溶態(tài)Fe和Zn，其中以有機(jī)態(tài)Fe和Zn為主。