拐棗果蔬酵素發(fā)酵條件的優(yōu)化

肖夢月，曹新志*，張楷正，趙迎慶，胡 琴

（1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.山東鳳凰生物有限公司，山東 泰安 271000）

拐棗學(xué)名枳椇（Hovenia acerba），又因其形似“萬”字又得名萬壽果，其富含糖類物質(zhì)和生物活性物質(zhì)。其中糖類物質(zhì)含量極高，總糖含量可達(dá)249.24 mg/g，還原糖含量可達(dá)167.57 mg/g[1]?，F(xiàn)有的研究表明，拐棗中含有多種脂肪酸、氨基酸、維生素和酚類化合物，這些成分可以直接或間接影響人體代謝，與健康密切相關(guān)[2-3]。相比一般的水果，拐棗中的多酚含量更為豐富，可達(dá)2.68 mg/g[4]，有研究發(fā)現(xiàn)，多酚具有抗腫瘤、抗病毒、抗誘變、預(yù)防心腦血管疾病等藥理作用并且還具有抗衰老、美白保濕等作用[5-6]。雖然拐棗果實營養(yǎng)價值極高，但因其形態(tài)特殊，所以可供直接食用的可食部分較少，并且略帶澀味，拐棗在我國的種植面積不大，甚至在有些農(nóng)村地區(qū)已經(jīng)絕跡。目前關(guān)于拐棗研究不多，現(xiàn)有產(chǎn)品有限，主要有拐棗酒，拐棗飲料和拐棗醋，還有很多研究是關(guān)于相關(guān)成分的提取和檢測[7-9]。將拐棗應(yīng)用于酵素產(chǎn)品，有助于提高拐棗農(nóng)產(chǎn)品的加工利用率，有望于將拐棗的有益物質(zhì)更好的得以利用。酵素本意指酶，現(xiàn)主要指各種原料經(jīng)微生物發(fā)酵后所得到的成品[10]。酵素制品可以在保留原料的有益成分的基礎(chǔ)上增加更多的有益物質(zhì)，有很多研究也證實了酵素所具有的一些功能特性，如解酒保肝、潤腸通便和抗氧化等[11-14]。日本在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)將酵素產(chǎn)品的生成作為技術(shù)來研究并進(jìn)入應(yīng)用階段，每天有超過2 000萬人在服用酵素產(chǎn)品，食用酵素在日本一年可達(dá)1 000億日元的消費額[15]。我國酵素行業(yè)起步較晚，目前尚少見到將拐棗全果應(yīng)用于酵素制作的相關(guān)研究，并且將四川泡菜水應(yīng)用于酵素發(fā)酵的研究也比較少見。四川泡菜水中微生物種類豐富，不僅含有乳酸菌而且還含有酵母菌和醋酸菌等[16]。本試驗以拐棗以及多種果蔬（拐棗、橘子、蘋果、梨、蘿卜、卷心菜、菠菜、檸檬、土豆、藕、西紅柿）作為混合原料制作酵素，將四川泡菜水用于酵素的發(fā)酵，以還原力和超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）酶活力作為檢測指標(biāo)，探索不同條件對拐棗果蔬酵素品質(zhì)的影響[17-18]。通過單因素試驗和正交試驗，最終得到拐棗果蔬酵素的最佳發(fā)酵條件。具有拐棗風(fēng)味的酵素產(chǎn)品的開發(fā)，不僅充分利用了拐棗中多酚含量高的優(yōu)勢，而且為提高拐棗的加工利用率提供了方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

紅糖、白砂糖、各種果蔬（拐棗、橘子、蘋果、梨、蘿卜、卷心菜、菠菜、檸檬、土豆、藕、西紅柿）、高活性安琪酵母：宜賓某超市；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：本實驗室保藏；四川泡菜水：實驗室自制。

1.1.2 化學(xué)試劑

沒食子酸、無水碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、十二水磷酸氫二鈉、鹽酸、二水磷酸二氫鈉（均為分析純）：成都市科隆化工試劑廠；福林酚試劑（分析純）：南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：牛肉膏6.0 g，蛋白胨6.0 g，酵母浸粉3.0 g，乙酸鈉3.0 g，磷酸氫二鉀1.2 g，吐溫-80（聚山梨脂-80）0.6mL，葡萄糖12.0g，MnSO4·4H2O0.15g，MgSO4·7H2O0.35g，檸檬酸銨1.2 g，蒸餾水600 mL，pH 6.2±0.2。121 ℃、0.1 MPa高壓滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上再加瓊脂15.0 g。121 ℃、0.1 MPa高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-250-S生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；KQ5200V超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TG-16臺式高速離心機(jī)：四川蜀科儀器有限公司；TGL-16B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-1000紫外可見分光光度計：上海翱藝儀器有限公司；868Thermo pH計：熱電（上海）儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 拐棗果蔬酵素工藝流程及操作要點

果蔬清洗→預(yù)處理→混合→調(diào)配→裝罐密封→一次發(fā)酵→過濾→二次發(fā)酵→拐棗果蔬酵素

操作要點：

預(yù)處理：將拐棗、橘子、蘋果、梨、蘿卜、卷心菜、菠菜、檸檬、土豆、藕、西紅柿等果蔬清洗干凈，并于通風(fēng)處自然晾干水分后去皮、去核并切丁，將切好的果蔬按質(zhì)量比為1∶1混合得到混合果蔬。

四川泡菜水的制備：芹菜2份、小米辣1份、生姜1份、泡蘿卜6份均清洗晾干備用。飲用水燒開晾至25～30 ℃，按8%的添加量加入食用鹽攪拌溶解。將經(jīng)預(yù)處理好的蔬菜裝入泡菜壇子，然后倒入鹽水，直至淹沒蔬菜，并在最上面撒一層大約0.03 cm厚度的食鹽。封罐：蓋上泡菜壇蓋以水封。定期檢查水封的水量，水量低于壇沿2/3立即將水補齊至壇沿；3月后即可獲得四川泡菜水。

菌株活化：酵母菌加入10倍蒸餾水于30 ℃水浴0.5 h活化酵母菌，植物乳桿菌于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)2 d，即可得到乳酸菌活化液。

調(diào)配：混合果蔬中加入35%混合糖（砂糖和紅糖質(zhì)量比為1∶1），再分別加入一定量的四川泡菜水、活化酵母菌及植物乳桿菌混勻。

裝罐密封：裝罐量為容積的80%，不可裝太滿。

一次發(fā)酵：在35 ℃條件下進(jìn)行恒溫發(fā)酵15 d，前7 d每天攪拌一次，每隔3 d取發(fā)酵液測定pH值，直至pH值穩(wěn)定不再下降后，即視為達(dá)到發(fā)酵終點。

過濾：一次發(fā)酵完成后用雙層紗布過濾。

二次發(fā)酵：將過濾后的一次發(fā)酵液密封后于常溫避光處二次發(fā)酵成熟30 d，得拐棗果蔬酵素。

1.3.2 檢測方法

（1）總酚含量的測定

樣液預(yù)處理：取發(fā)酵液在4 000 r/min條件下離心15 min。

參考福林酚比色法測定核桃青皮果蔬酵素中的總酚含量[18]，在25 mL刻度試管中加入經(jīng)稀釋10倍的樣液，然后加入2.5 mL10%的福林酚試劑，混勻之后靜置3 min，最后加入1 mL 12%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至25 mL，置于45 ℃水浴鍋中遮光顯色30 min，取出后迅速冷卻于696 nm波長條件下測定吸光度值。以不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣液測定吸光度值，以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.0720 0x+0.005 6，R2=0.999 6。

（2）還原力的檢測

參考毛酸漿酵素還原力的測定方法[19]，取經(jīng)預(yù)處理后的發(fā)酵液0.2 mL，加入2.5 mL濃度為0.2 moL/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6），然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鐵氰化鉀溶液，于50 ℃水浴20 min后快速冷卻，然后加入2.5 mL 體積分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸溶液，于3 600 r/min離心15 min后立即取上清液2.5 mL，加入去離子水2.5 mL和0.1%三氯化鐵0.5 mL。以去離子水作參比在波長700 nm處測定吸光度值（OD700nm值）。吸光度值越大，說明還原能力越強(qiáng)，抗氧化效果越好。

（3）SOD酶活力的檢測

參考國標(biāo)GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》[20]，于25 ℃左右，取經(jīng)預(yù)處理并適當(dāng)稀釋的樣液0.2 mL于試管中，然后依次將2.35 mL濃度為0.1 moL/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液（pH為8.2，內(nèi)含1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid-2Na，EDTA-2Na））、1.8 mL蒸餾水、0.15 mL 4.5 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后立即倒入石英比色皿中在波長325 nm條件下分別測定初始時和1 min后的吸光度值，二者之差則為A1，空白比色皿用10 mmol/L鹽酸調(diào)零，同樣地用蒸餾水代替樣液測定吸光度值A(chǔ)0，SOD酶活性計算公式如下：

超氧化物歧化酶活力定義：25 ℃時抑制鄰苯三酚自氧化速率50%所需的SOD量為一個活力單位（U）。

1.3.3 原料對總酚含量和發(fā)酵時間的影響

將經(jīng)預(yù)處理后的除拐棗外的所有果蔬原料（橘子、蘋果、梨、蘿卜、卷心菜、菠菜、檸檬、土豆、藕、西紅柿）按1∶1質(zhì)量比混合得到混合果蔬原料，然后按照不同拐棗添加量分組，第一組不添加拐棗，第二組拐棗與混合果蔬的質(zhì)量比為1∶4，第三組拐棗與混合果蔬的質(zhì)量比為1∶3。然后分別按原料∶白砂糖∶紅糖=4∶1∶1（g∶g）進(jìn)行調(diào)配，加入2%的泡菜水置于35 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，每隔3 d取發(fā)酵液測定pH值，直至pH值穩(wěn)定取樣測定其總酚含量。

1.3.4 糖的種類對發(fā)酵的影響

將經(jīng)預(yù)處理后的的除拐棗外的所有果蔬原料（橘子、蘋果、梨、蘿卜、卷心菜、菠菜、檸檬、土豆、藕、西紅柿按1∶1的質(zhì)量比混合）混合得到混合果蔬原料，將拐棗與混合果蔬原料按1∶4的質(zhì)量比混合，等量分為3個樣品組，分別添加白砂糖50%、紅糖50%、混合糖50%，3個樣品組菌接種泡菜水2%，置于35 ℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵，每隔3 d取發(fā)酵液測定pH值，直至pH值穩(wěn)定不再下降后取發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行還原力和SOD酶活力的測定。

1.3.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

（1）加糖量的選擇

前處理方式不變，將樣品進(jìn)行編號1～4號，在調(diào)配時分別加入混合糖（砂糖和紅糖質(zhì)量比為1∶1）20%、30%、40%、50%，每個樣品均添加2%的泡菜水，然后在35 ℃條件下進(jìn)行恒溫發(fā)酵，每隔3 d取發(fā)酵液測定pH值，直至pH值穩(wěn)定不再下降后取發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行還原力和SOD酶活力的測定。

（2）菌種的選擇

前處理方式不變，調(diào)配時加入30%的混合糖（砂糖和紅糖質(zhì)量比為1∶1），將樣品進(jìn)行編號1～6號，分別加入酵母菌2%、4%，乳酸菌2%、4%，四川泡菜水2%、4%。在35 ℃條件下進(jìn)行恒溫發(fā)酵，每隔3 d取發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行還原力和SOD酶活力的測定。

（3）發(fā)酵溫度的選擇

前處理方式不變，調(diào)配時加入30%的混合糖（砂糖和紅糖質(zhì)量比為1∶1）與2%的泡菜水，將樣品進(jìn)行編號1～4號，分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃條件下進(jìn)行恒溫發(fā)酵，每隔3 d取發(fā)酵液測定pH值，直至pH值穩(wěn)定不再下降后取發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行還原力和SOD酶活力的測定。

1.3.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗，考察混合糖（砂糖和紅糖質(zhì)量比為1∶1）添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）和四川泡菜水接種量（C）3個因素共同作用對拐棗果蔬酵素的影響，一次發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵液的還原力和SOD酶活性進(jìn)行測定，每個樣品重復(fù)測3次，最后結(jié)果取平均值，根據(jù)測定結(jié)果最終選擇出最優(yōu)工藝條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 原料對總酚含量和發(fā)酵時間的影響

圖1 不同原料對總酚含量和發(fā)酵時間的影響Fig.1 Effect of different raw materials on total phenol content and fermentation time

由圖1可知，不同拐棗添加量對酵素總酚含量影響較大，拐棗的加入能夠明顯提升酵素中總酚含量，其中第一組無拐棗組的總酚含量為1.32 mg/mL，第二組拐棗與混合果蔬的質(zhì)量比為1∶4時，總酚含量為2.35 mg/mL，第三組拐棗與混合果蔬的質(zhì)量比為1∶3時，總酚含量上升至2.63 mg/mL，上升幅度不是很明顯。同時可以看出拐棗的添加量對發(fā)酵時間有較明顯的影響，拐棗的加入會延長發(fā)酵時間。所以綜合兩種因素考慮，最終選擇拐棗與混合果蔬的最適質(zhì)量比為1∶4。

2.2 糖種類選擇結(jié)果

由圖2可知，添加了混合糖的酵素樣品的SOD酶活力和還原力明顯高于單一糖種類樣品，且僅添加白糖的樣品組SOD酶和還原力最低分別為121.6 U/mL和1.534（OD700nm值），這說明紅糖和白砂糖混合發(fā)酵效果要優(yōu)于單一糖種類發(fā)酵，這可能是因為紅糖相比白砂糖含更多的微量元素，較適宜微生物發(fā)酵。但是僅用紅糖進(jìn)行發(fā)酵，所得酵素的還原力和SOD酶活力也低于混合糖發(fā)酵，這可能是因為只添加紅糖發(fā)酵酵素樣品更容易受到其他雜菌的影響，最終導(dǎo)致酵素的品質(zhì)比混合糖發(fā)酵酵素品質(zhì)低。所以選擇砂糖和紅糖最適質(zhì)量比為1∶1。

圖2 糖種類對還原力和超氧化歧化酶活力的影響Fig.2 Effect of sugar types on reducing power and superoxide dismutase activity

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 加糖量的選擇

圖3 混合糖添加量對還原力和超氧化歧化酶活力的影響Fig.3 Effect of mixed sugar addition on reducing power and superoxide dismutase activity

由圖3可知，糖的添加量對酵素的SOD酶活力和還原力均會產(chǎn)生影響，隨著糖添加量的增大，SOD酶活力出現(xiàn)了先增大后降低的現(xiàn)象，這可能是過高的糖添加反而會抑制微生物的生長繁殖，最終導(dǎo)致所產(chǎn)酶活力下降。還原力是隨著糖添加量的增大而一直增大，這可能是由于糖添加量的增多，被微生物所分解成為還原糖的量也越大，所以最終導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束時還原力很大。但是總體來說30%的混合糖添加量與50%混合糖添加量條件下還原力和SOD酶活力分別為1.345（OD700nm值）、1.502（OD700nm值）和171.2 U/mL、156.2 U/mL，其中還原力差別不是特別明顯，而SOD酶活力30%糖添加量情況下更多，且較多的糖添加量還會延長發(fā)酵時間。所以選擇混合糖（砂糖和紅糖質(zhì)量比為1∶1）的最適添加量為30%。

2.3.2 發(fā)酵溫度選擇結(jié)果

圖4 發(fā)酵溫度對還原力和超氧化歧化酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on reducing power and superoxide dismutase activity

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酵素樣品的SOD酶活性和還原力均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其中30 ℃和35 ℃條件下發(fā)酵的酵素樣品的還原力和SOD酶活性明顯高于25 ℃和40 ℃條件下發(fā)酵的，這說明適宜的溫度對發(fā)酵效果十分重要。25 ℃發(fā)酵溫度過低，可能不適宜目的微生物生長，所以導(dǎo)致發(fā)酵不完全且所需發(fā)酵時間較長而40 ℃發(fā)酵溫度過高，可能會抑制目的微生物生長，并且40 ℃樣品的活力較25 ℃更低。35 ℃樣品兩者指標(biāo)均最高還原力和SOD酶活力分別為1.932（OD700nm值）、205.4 U/mL。所以選擇最適發(fā)酵溫度為35 ℃。

2.3.3 菌種的選擇結(jié)果

圖5 不同菌種對還原力和超氧化歧化酶活力的影響Fig.5 Effect of different strains reducing power and superoxide dismutase activity

由圖5可知，加入不同的菌種對酵素樣品的SOD酶活力和還原力有很大影響，且由圖可知影響效果為：泡菜水＞乳酸菌＞酵母菌。這可能是由于四川泡菜水中微生物種類豐富，不僅有多種乳酸菌，還有醋酸菌和酵母菌等，并且本試驗用的老泡菜水（制作超過3個月以上）菌落總數(shù)達(dá)105CFU/mL以上，產(chǎn)酸能力強(qiáng)。所以選擇泡菜水作為接下來正交試驗的菌種。

2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果

在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗，以發(fā)酵液的還原力和SOD酶活性為考察指標(biāo)，考察混合糖添加量（A），發(fā)酵溫度（B）和四川泡菜水接種量（C）3個因素共同作用對拐棗果蔬酵素的影響，正交試驗結(jié)果與分析見表2。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

由表2可知，影響酵素樣品SOD酶活力和還原力的因素主次順序為A＞B＞C，混合糖的添加量是影響酵素樣品的SOD酶活力和還原力的最主要的因素，這可能是由于本試驗的酵素樣品都發(fā)酵較完全，所以糖的添加量在較大程度上決定了發(fā)酵的周期，因而影響了酵素的產(chǎn)物。對于SOD酶活力和還原力而言，兩種指標(biāo)均越大越好，所以從兩種指標(biāo)都可得出最優(yōu)發(fā)酵工藝組合是A2B2C3，即拐棗果蔬酵素的最佳發(fā)酵工藝為混合糖添加量30%，發(fā)酵溫度35 ℃，四川泡菜水接種量4%。在此最佳發(fā)酵工藝條件下，SOD酶活力及還原力（OD700nm值）分別為270 U/mL和2.165（OD700nm值）。

3 結(jié)論

本試驗以拐棗和多種果蔬為原料，以四川老泡菜水為菌種母液，通過對不同原料發(fā)酵的酵素樣品的總酚檢測，以拐棗與混合果蔬按照1∶4質(zhì)量比進(jìn)行拐棗果蔬酵素的研制，最終得出拐棗果蔬酵素的最佳工藝條件為混合糖添加量30%、發(fā)酵溫度35 ℃、四川泡菜水接種量為4%，發(fā)酵15 d，在此優(yōu)化條件下得到的酵素超氧物歧化酶（SOD）活性為270 U/mL，還原力為2.165（OD700nm值），總酚含量為3.38 mg/mL，經(jīng)過30 d熟成后顏色呈悅?cè)说臏\紅棕色，發(fā)酵液清澈，酸甜適口，香氣濃郁，并無不良風(fēng)味。