飼喂幼蟲(chóng)糞便提取物對(duì)馬鈴薯塊莖蛾生殖的影響

劉 燕，李宗鍇*，韓 瑞，王 靜，胡純?nèi)A，肖 春**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)與繼續(xù)教育學(xué)院，云南 昆明 650201)

0 前言

馬鈴薯塊莖蛾(Phthorimaeaoperculella)是一種典型的寡食性害蟲(chóng)，寄主范圍僅限于茄科植物，且最嗜食馬鈴薯塊莖[1]。該蟲(chóng)是馬鈴薯種植業(yè)上的最重要害蟲(chóng)之一，在塊莖貯存期為害尤其嚴(yán)重，其中貯存期超過(guò)半年以上的塊莖被害率可達(dá)100%[2]。因此，研發(fā)安全、高效的防治技術(shù)，對(duì)于控制馬鈴薯塊莖蛾的發(fā)生與為害極為重要。

性誘劑應(yīng)用是防治害蟲(chóng)的重要技術(shù)之一，具有安全、高效、專(zhuān)一性強(qiáng)、不傷害天敵、不污染環(huán)境的優(yōu)勢(shì)。馬鈴薯塊莖蛾的性信息素研究早有報(bào)道[3]，但性誘劑在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用效果極其少見(jiàn)[4]，原因可能和馬鈴薯塊莖蛾存在著孤雌生殖的爭(zhēng)論有關(guān)。因?yàn)樾哉T劑的作用方式是阻斷昆蟲(chóng)兩性之間的交配行為，進(jìn)而達(dá)到降低害蟲(chóng)后代種群的目的。因此，性誘劑只適合應(yīng)用于兩性生殖的害蟲(chóng)種類(lèi)的防治，對(duì)于具有孤雌生殖特性的種類(lèi)則效果不佳[5]。

關(guān)于馬鈴薯塊莖蛾是否存在著孤雌生殖現(xiàn)象一直存有爭(zhēng)論。有報(bào)道顯示，馬鈴薯塊莖蛾的孤雌生殖率可達(dá)50%以上[6]，而有些研究則報(bào)道該蟲(chóng)并不存在孤雌生殖或者發(fā)生率極低[7]。最新研究結(jié)果顯示，在馬鈴薯塊莖蛾中確實(shí)存在著孤雌生殖現(xiàn)象；孤雌生殖的發(fā)生與塊莖中的幼蟲(chóng)密度緊密相關(guān)[8]。也就是說(shuō)誘發(fā)孤雌生殖的因素在幼蟲(chóng)體內(nèi)就已經(jīng)形成了。那么，這種因素是否會(huì)隨糞便排出體外、并且具有影響雌蟲(chóng)孤雌生殖發(fā)生的活性？孤雌生殖個(gè)體的產(chǎn)卵特征是什么？回答這些問(wèn)題將有助于進(jìn)一步揭示馬鈴薯塊莖蛾生殖方式轉(zhuǎn)變及種群自我調(diào)節(jié)的機(jī)制。為此，作者開(kāi)展了飼喂幼蟲(chóng)糞便提取物對(duì)馬鈴薯塊莖蛾生殖及產(chǎn)卵的影響的研究。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)源

馬鈴薯塊莖蛾采自云南省宣威市，幼蟲(chóng)以正常密度(15頭/130 g塊莖，ND)用馬鈴薯塊莖飼養(yǎng)。當(dāng)卵孵化后，將初孵幼蟲(chóng)接入到新鮮塊莖上，之后幼蟲(chóng)會(huì)蛀入到塊莖內(nèi)取食、生長(zhǎng)。將接有幼蟲(chóng)的塊莖置于養(yǎng)蟲(chóng)籠(24 cm×24 cm×24 cm)內(nèi)的細(xì)沙上。幼蟲(chóng)在取食過(guò)程中會(huì)從塊莖中將糞便排出至塊莖表面形成黑色塊狀物，老熟后從塊莖中脫出并入沙、結(jié)繭、化蛹。成蟲(chóng)羽化后按1∶1配對(duì)置于產(chǎn)卵盒(Φ=13 cm，h=14.5 cm)中，成蟲(chóng)產(chǎn)卵于濾紙表面[9]。每天用10%蜂蜜水(FM)為成蟲(chóng)提供補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，并定時(shí)收集蟲(chóng)卵備用。室內(nèi)環(huán)境條件：溫度(25±2)℃，光周期L∶D = 14 h∶10 h，相對(duì)濕度為50%～70%。

按照上述方法，將初孵幼蟲(chóng)以高密度(45頭/130 g塊莖，HD)接入塊莖中，之后4～6 d內(nèi)收集幼蟲(chóng)產(chǎn)生的新鮮蟲(chóng)糞。取5 g新鮮蟲(chóng)糞和10 g蜂蜜加蒸餾水配制成100 mL溶液，充分?jǐn)嚢韬箪o置5 h得蟲(chóng)糞提取物(ELF)。將提取物過(guò)濾后取濾液于冰箱(<-5 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 飼喂幼蟲(chóng)糞便提取物對(duì)孤雌生殖發(fā)生的影響

將馬鈴薯塊莖(80±10)g置于220 mL紙杯中，并在杯中放置浸有4 mL補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液的棉團(tuán)(Φ=1 cm)，將1頭剛羽化的ND雌蟲(chóng)置于杯中并用尼龍紗網(wǎng)封口以阻隔雌蟲(chóng)與雄蟲(chóng)的接觸。8 d后觀察馬鈴薯上有無(wú)幼蟲(chóng)糞便出現(xiàn)，有蟲(chóng)糞者視為孤雌生殖發(fā)生。之后將有蟲(chóng)糞的塊莖移入到養(yǎng)蟲(chóng)籠中，直至蛹出現(xiàn)，待成蟲(chóng)羽化后記錄雌雄比。

利用上述方法，分別測(cè)定：ND雌蟲(chóng)+10%蜂蜜水(對(duì)照，ND/FM)、ND雌蟲(chóng)+蟲(chóng)糞提取物(ND/ELF)、HD雌蟲(chóng)+10%蜂蜜水(HD/FM)等3種組合下雌蟲(chóng)的孤雌生殖率。每處理觀察30頭雌蟲(chóng)，重復(fù)4次。

1.3 飼喂幼蟲(chóng)糞便提取物對(duì)雌蟲(chóng)產(chǎn)卵量及卵粒的影響

1.3.1 對(duì)未交配雌蟲(chóng)產(chǎn)卵的影響 采用步驟1.2的方法用幼蟲(chóng)糞便提取物飼喂雌蟲(chóng)。將5頭剛羽化的ND雌蟲(chóng)置于產(chǎn)卵盒中，每天飼喂4 mL幼蟲(chóng)糞便提取物(ELF)，分別以喂食4 mL蜂蜜水的ND雌蟲(chóng)和HD雌蟲(chóng)為對(duì)照。每天收取卵粒，直至雌蟲(chóng)死亡。使用體視顯微鏡檢查卵的外觀并統(tǒng)計(jì)卵量。重復(fù)4次。

雌蟲(chóng)卵粒從外觀上看可分為3類(lèi)：正常卵、畸形卵和干癟卵。正常卵飽滿，橢圓形；畸形卵表面嚴(yán)重凹陷、有皺褶；干癟卵只剩卵殼，也稱(chēng)無(wú)效卵(圖1)。

1.3.2 對(duì)已交配雌蟲(chóng)產(chǎn)卵的影響 將1日齡ND雌蟲(chóng)、ND雄蟲(chóng)分別置于產(chǎn)卵籠中喂食幼蟲(chóng)糞便提取物(ELF)并保持1 d，之后取5對(duì)雌、雄蟲(chóng)(2日齡)按1∶1比例配對(duì)置于其它產(chǎn)卵盒中，喂以蜂蜜水。另外分別取5頭雌、雄蟲(chóng)(ND/ELF)與同日齡異性(ND/FM，僅取食蜂蜜)按1∶1比例配對(duì)后置于產(chǎn)卵盒中，每天喂以蜂蜜水。重復(fù)4次。

另取5對(duì)2日齡ND雌雄蟲(chóng)(僅喂食蜂蜜，CK1)、5對(duì)2日齡HD雌雄蟲(chóng)(僅喂食蜂蜜，CK2)分別置于產(chǎn)卵盒中以便完成交配、產(chǎn)卵。每天喂以蜂蜜水(FM)。重復(fù)4次。次日開(kāi)始收集卵粒，直到雌蟲(chóng)死亡，統(tǒng)計(jì)單雌產(chǎn)卵量和孵化率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，利用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析(ANOVA，α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂幼蟲(chóng)糞便提取物對(duì)馬鈴薯塊莖蛾孤雌生殖發(fā)生的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，以正常密度[15頭/(130±2)g塊莖，ND]飼養(yǎng)幼蟲(chóng)時(shí)，在馬鈴薯塊莖蛾中不會(huì)出現(xiàn)孤雌生殖現(xiàn)象；而以高密度[45頭/(130±2)g塊莖，HD]飼養(yǎng)幼蟲(chóng)時(shí)，雌蛾的孤雌生殖率可達(dá)10%左右，且以孤雌生殖模式所繁殖的后代雌雄比為1.4。用正常密度飼養(yǎng)幼蟲(chóng)獲得的雌蛾，如果喂以高密度幼蟲(chóng)的糞便提取物(ELF),則可誘發(fā)孤雌生殖的發(fā)生，其發(fā)生率可達(dá)2.5%左右，而且由孤雌生殖而來(lái)的后代雌雄比為2.0。

2.2 飼喂幼蟲(chóng)糞便提取物對(duì)馬鈴薯塊莖蛾產(chǎn)卵的影響

2.2.1 飼喂幼蟲(chóng)糞便提取物對(duì)未交配雌蟲(chóng)產(chǎn)卵的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，未交配雌蛾產(chǎn)的正常卵外觀飽滿，卵黃明顯，呈橢圓形；而畸形卵表面通常有凹陷、皺褶，卵黃明顯；無(wú)效卵僅有卵殼，內(nèi)無(wú)明顯卵黃(圖1)。其中無(wú)效卵為主要類(lèi)型，正常卵所占比例最低(表2)。

1.正常卵；2.畸形卵；3.干癟卵。

表1 飼喂幼蟲(chóng)糞便提取物對(duì)馬鈴薯塊莖蛾孤雌生殖發(fā)生的影響

注：數(shù)字后面的字母a、b、c表示不同處理間的差異顯著性(方差齊性檢驗(yàn)，df1=2，df2=9，P=0.184；ANOVA，F(xiàn)=31.978，P<0.001)。

在沒(méi)有交配的條件下，不論是由正常密度還是高密度幼蟲(chóng)飼養(yǎng)而獲得的雌蟲(chóng)產(chǎn)卵量均較低，單雌產(chǎn)卵量不超過(guò)20粒；而在飼喂ELF后，ND雌蟲(chóng)產(chǎn)卵量也極低(平均19.6粒)，與前兩者不存在顯著差異(表2)。

在僅喂食蜂蜜時(shí)，HD雌蟲(chóng)產(chǎn)生的卵粒中正常卵粒所占比例顯著高于ND雌蟲(chóng)。而ND雌蟲(chóng)在取食ELF后正常卵粒所占比例得到顯著提高(表2)。

表2 飼喂幼蟲(chóng)糞便提取物對(duì)馬鈴薯塊莖蛾未交配雌蟲(chóng)產(chǎn)卵的影響

注：字母a、b、c表示不同處理間的差異顯著性(α=0.05)。其中，正常卵(方差齊性檢驗(yàn)，df1=2，df2=9，pP=0.619；ANOVA，F(xiàn)=6.523，P=0.018)，無(wú)效卵(方差齊性檢驗(yàn)，df1=2，df2=9，P=0.995；ANOVA，F(xiàn)=5.056，P=0.034)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同時(shí)顯示，在未交配狀態(tài)下ND雌蟲(chóng)(僅喂食蜂蜜)所產(chǎn)出的卵中無(wú)效卵比例高達(dá)77.6%，顯著高于HD雌蛾(僅喂食蜂蜜)的66.4%。而喂食ELF的ND雌蛾產(chǎn)下的卵粒中無(wú)效卵占73.6%，與另外兩種處理均無(wú)顯著差異(表2)?；温言诳偮蚜Ｖ兴急壤?種處理間均不存在顯著差異(表2)。

2.2.2 飼喂幼蟲(chóng)糞便提取物對(duì)交配雌蟲(chóng)產(chǎn)卵的影響 從單雌產(chǎn)卵量來(lái)看，HD雌蟲(chóng)(CK2)在交配后的產(chǎn)卵量最低，僅為142±16.7粒，顯著低于ND雌蟲(chóng)(CK1)的211±20.3粒。如果單獨(dú)給ND雌蟲(chóng)、ND雄蟲(chóng)喂ELF，或者同時(shí)給ND雌雄蟲(chóng)喂食ELF，則雌蟲(chóng)交配后的落卵量與對(duì)照(CK1)相比均無(wú)顯著差異。但如果讓ND雌雄蟲(chóng)同時(shí)取食ELF后再進(jìn)行交配，則雌蟲(chóng)單雌產(chǎn)卵量可達(dá)233.0±18.0粒，顯著高于HD雌蟲(chóng)(CK2)的產(chǎn)卵量，而與ND雌蟲(chóng)(CK1)無(wú)顯著差異(表3)。

在僅喂食蜂蜜的條件下，HD雌蟲(chóng)(CK2)卵的孵化率最低，僅為(81.8±1.4)%，顯著低于ND雌蟲(chóng)(CK1)的(92.6±0.9)%。與對(duì)照(CK1)相比，ND雄蟲(chóng)在取食ELF后若再與雌蟲(chóng)(僅喂食蜂蜜)交配，則卵孵化率僅為(82.0±2.3)%，顯著低于CK1的(92.6±0.9)%，與CK2的(81.8±1.4)%無(wú)顯著差異。如果讓ND雌蟲(chóng)取食ELF后與ND雄蟲(chóng)(僅喂食蜂蜜)、或者ND雌雄蟲(chóng)同時(shí)取食ELF，則卵孵化率均與CK1無(wú)顯著差異(表3)。

至于雌蟲(chóng)所產(chǎn)畸形卵量，在各處理間均無(wú)顯著差異。

3 討論

孤雌生殖是昆蟲(chóng)中比較常見(jiàn)的一種生殖方式。有許多種類(lèi)既可以行兩性生殖，也可行孤雌生殖[10,11]。許多研究結(jié)果表明，孤雌生殖的發(fā)生是對(duì)極端環(huán)境的一種適應(yīng)，比如應(yīng)對(duì)食物/寄主匱乏[12,13]、適應(yīng)高溫[14]等。

表3 飼喂幼蟲(chóng)糞便提取物對(duì)馬鈴薯塊莖蛾交配雌蟲(chóng)產(chǎn)卵的影響

注：孵化率是指全部落卵的孵化率。字母a、b、c表示不同處理間的差異顯著性(α=0.05)，其中單雌產(chǎn)卵量(方差齊性檢驗(yàn)，df1=4，df2=15，P=0.822；ANOVA，F(xiàn)=4.059，P=0.02)，畸形率為(方差齊性檢驗(yàn)，df1=4，df2=15，P=0.161；ANOVA，F(xiàn)=1.524，P=0.245)，孵化率(方差齊性檢驗(yàn)，df1=4，df2=15，P=0.605；ANOVA，F(xiàn)=9.965，P<0.0001)。

在馬鈴薯塊莖蛾中，孤雌生殖只有在塊莖幼蟲(chóng)數(shù)量超過(guò)一定限度時(shí)才會(huì)產(chǎn)生[8]。這說(shuō)明孤雌生殖產(chǎn)生主要是為了應(yīng)對(duì)食物資源匱乏而采取的一種生殖策略。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，喂食高密度幼蟲(chóng)產(chǎn)生的糞便提取物ELF能夠誘發(fā)孤雌生殖現(xiàn)象的發(fā)生(表1)。這一事實(shí)說(shuō)明孤雌生殖誘發(fā)因子(Parthenogenesis-inducing factors, PIF)在幼蟲(chóng)期內(nèi)即開(kāi)始發(fā)揮作用。這也同時(shí)說(shuō)明，這些誘發(fā)因素(PIF)可能隨幼蟲(chóng)糞便排除體外。這顯示誘發(fā)因素可能存在于腸道中，甚至可能與腸道中的微生物有關(guān)[14,15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在未交配時(shí)，不論是正常密度幼蟲(chóng)飼養(yǎng)、還是高密度幼蟲(chóng)飼養(yǎng)所獲得的雌蟲(chóng)，其產(chǎn)卵量均很低；在給正常密度雌蛾喂食幼蟲(chóng)糞便提取物ELF后，未交配雌蟲(chóng)的產(chǎn)卵量也與前兩者沒(méi)有顯著差異(表2)。這說(shuō)明，PIF沒(méi)有刺激雌蟲(chóng)產(chǎn)卵的功效。

那么，當(dāng)環(huán)境改變后、昆蟲(chóng)體內(nèi)的誘發(fā)因素PIF被激活時(shí)，會(huì)使馬鈴薯塊莖蛾產(chǎn)卵發(fā)生哪些變化呢？ 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)可以看出，幼蟲(chóng)高密度飼養(yǎng)時(shí)，未交配雌蛾產(chǎn)下的正常卵量顯著高于正常密度飼養(yǎng)的雌蛾，由高密度幼蟲(chóng)羽化而來(lái)的處女雌蛾(HD♀)產(chǎn)下的正常卵?？蛇_(dá)總卵量的4.5%左右，遠(yuǎn)高于正常密度雌蟲(chóng)(ND♀)的1.7%。更進(jìn)一步觀察顯示，當(dāng)誘發(fā)因子PIF進(jìn)入ND♀體內(nèi)后，則可誘使未交配雌蛾體內(nèi)正常卵粒的比例顯著增加。如ND♀在取食幼蟲(chóng)糞便提取物(ELF)后，正常卵粒比例亦得到顯著升高，達(dá)到3.9%(表2)。這在一定程度上說(shuō)明，誘發(fā)因子PIF具有促進(jìn)卵粒發(fā)育的作用，而正常卵粒的增加正是孤雌生殖發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。這說(shuō)明蟲(chóng)體內(nèi)誘發(fā)因子PIF可能參與了卵母細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控。這與有關(guān)報(bào)道的結(jié)果較相似[16]。

更進(jìn)一步的結(jié)果顯示，與對(duì)照(CK1)相比，在交配前，不論是給ND♀還是ND♂，或者同時(shí)給ND♀、ND♂喂食幼蟲(chóng)糞便提取物，則ND成蟲(chóng)交配后的單雌產(chǎn)卵量均無(wú)顯著變化(表3)。這進(jìn)一步說(shuō)明，PIF不會(huì)刺激雌蛾產(chǎn)卵。

有意思的是，喂食ELF雖然不會(huì)刺激雌蟲(chóng)產(chǎn)卵，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，給予ND♂喂食ELF后再與未接觸過(guò)ELF的ND♀交配，則造成卵孵化率顯著下降(表3)。這說(shuō)明，PIF在一定程度上具有抑制雄蟲(chóng)生殖力的作用。這種現(xiàn)象在其它昆蟲(chóng)的孤雌生殖現(xiàn)象中也存在[17]。

綜上所述，孤雌生殖的發(fā)生是馬鈴薯塊莖蛾對(duì)不利環(huán)境的一種適應(yīng)性表現(xiàn)。即在食物極端匱乏的情形下，為了降低種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)、保持種群順利繁衍，種群必須降低自身繁殖力，以實(shí)現(xiàn)有限資源的高效利用[18]。而降低種群自身繁殖力是通過(guò)PIF來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)的，PIF被激活后，可以促進(jìn)卵粒的發(fā)育，以提高孤雌生殖的效率；且交配會(huì)顯著提高雌蟲(chóng)的產(chǎn)卵量，而PIF被激活后，雄蟲(chóng)的生殖潛力會(huì)受到顯著抑制，從而導(dǎo)致種群繁殖力下降。但馬鈴薯塊莖蛾體內(nèi)的PIF究竟是什么，尚需要進(jìn)行更深入的研究。