CO2調(diào)控金針菇活性物質(zhì)變化

甄彩云， 明 秋， 朱婷婷， 夏德寧， 蔣圣娟

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

金針菇(Flammulinavelutipes(Fr.) Sing)屬傘菌目白蘑科金針菇屬,因其菌柄細(xì)長,似金針菜,故而得名。金針菇是百姓餐桌上常見的食材,其干品中富含蛋白質(zhì),多糖類[1],多酚類等,具有抗菌、抗腫瘤、保護(hù)肝臟[2]、降血脂、提高神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知[3]等功效,因此,金針菇藥用價(jià)值高,市場需求量大。在金針菇的工廠優(yōu)化栽培空間里,CO2濃度對(duì)金針菇的生長發(fā)育具有十分重要的作用。

大多數(shù)的食用菌不能耐受高CO2濃度,可是對(duì)于金針菇而言,高濃度的CO2可以抑制菌蓋開傘,促進(jìn)菌柄伸長,從而獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的金針菇。CO2是一種重要的維持大氣平衡的氣體分子[4],也是活細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)分子,高濃度的CO2將會(huì)引起生物體的異常生理反應(yīng),誘導(dǎo)基因的表達(dá)變化[5]。谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)是生物體內(nèi)廣泛存在的一種酶,以磷酸吡哆醛作為輔助因子不可逆地催化谷氨酸脫羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。GABA是天然存在的非蛋白質(zhì)組成氨基酸,也是一種重要的生理代謝物,以信號(hào)分子的形式參與高等植物生長發(fā)育的生理過程[6],比如:植物的機(jī)械損傷,缺氧,干旱和抗寒脅迫等[7],且其代謝過程受到環(huán)境因子的嚴(yán)格調(diào)控。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是細(xì)胞內(nèi)含氮類激素的第二信使,由腺苷酸環(huán)化酶催化ATP環(huán)化而成,在動(dòng)物,植物,真菌體內(nèi)發(fā)揮著調(diào)控信號(hào)通路的作用[8-9]。這三物質(zhì)作為信號(hào)分子在細(xì)胞的異常生理進(jìn)程中發(fā)揮著十分重要的作用。另外,CO2與食用菌活性物質(zhì)合成相關(guān),引起物質(zhì)含量(如蛋白質(zhì),糖類等)發(fā)生變化[10]。CO2對(duì)金針菇子實(shí)體生長發(fā)育的影響勢必通過誘導(dǎo)或調(diào)控子實(shí)體內(nèi)眾多代謝和生理發(fā)育相關(guān)的物質(zhì)含量的變化來實(shí)現(xiàn)。

本研究通過套袋的方法人為積累高濃度CO2,測定高濃度和正常培養(yǎng)條件下金針菇的GABA、GAD、cAMP的變化,同時(shí)測定基本代謝物如蛋白質(zhì),還原糖,多酚的含量變化。研究結(jié)果將豐富CO2調(diào)控金針菇生長發(fā)育的理論體系,并為工廠化生產(chǎn)實(shí)踐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

金針菇在安徽科技學(xué)院食用菌栽培基地種植培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

756-MC型可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);Multiskan GO,全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific);YXQ-LS50S11立式壓力蒸汽滅菌器(上海云泰儀器儀表有限公司);TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司);XHF-D高速分散器(寧波新芝生物科技股份有限公司)等。考馬斯亮藍(lán)G-250,3,5-二硝基水楊酸,沒食子酸,碳酸鈉等均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司)。GABA、cAMP、GAD酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海心語生物科技有限公司)。

1.3 金針菇的培養(yǎng)與處理

將棉籽殼與麥麩按6∶1加水?dāng)嚢杈鶆?調(diào)節(jié)pH 6,裝瓶,120 ℃滅菌90 min。冷卻后,在超凈工作臺(tái)上接種,25 ℃培養(yǎng)。將長滿菌絲體的培養(yǎng)瓶按出菇整齊度分為4組,每組20瓶,其中10瓶高CO2濃度下生長(套袋組),10瓶自然生長(不套袋組),每天噴灑水保持濕度。分別間隔3 d采樣,分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。

1.4 樣品制備

準(zhǔn)確稱取金針菇樣品1 g于勻漿器中,加8 mL蒸餾水研磨成勻漿,冰上靜置60 min充分提取,6 000 rpm離心20 min,上清液即為提取液。

1.5 蛋白質(zhì)含量測定

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,考馬斯亮藍(lán)法測定。各試管中分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白或待測液,然后每支試管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,充分混合后放置2 min,用分光光度計(jì)在595 nm波長下測定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算。

1.6 還原糖含量測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定。各管分別加入不同體積標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液或待測樣本,DNS溶液,充分搖勻,在沸水浴中加熱5 min,取出冷卻至室溫,分別用蒸餾水定容至20 mL,加塞后顛倒混勻,于分光光度計(jì)在540 nm測定。標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖結(jié)果用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣本中還原糖含量。

1.7 多酚含量測定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,福林酚法測定。各試管中分別不同濃度的沒食子酸溶液或待測樣本,加入福林酚試劑1 mL,5 min后,加入1 mL的7.5%的碳酸鈉溶液并加蒸餾水定容至10 mL,搖勻,室溫黑暗條件下靜置90 min,以蒸餾水作為對(duì)照,在725 nm處測定吸光度。

增值稅的價(jià)外計(jì)稅、避免重復(fù)征稅的稅制設(shè)計(jì)是國家從宏觀管理經(jīng)濟(jì)良性運(yùn)行采用的措施，而對(duì)每個(gè)流轉(zhuǎn)環(huán)節(jié)的單個(gè)獨(dú)立企業(yè)，一般并不關(guān)注重復(fù)征稅的問題，企業(yè)管理者需要考慮的是稅款的繳納對(duì)資金的占用及其在與交易對(duì)手商品價(jià)格博弈中的影響，進(jìn)而對(duì)企業(yè)利潤的影響。實(shí)務(wù)中企業(yè)運(yùn)用的各種增值稅稅收籌劃手段,如一般納稅人與小規(guī)模納稅人主體資格的選擇、不同計(jì)稅方式的選擇、對(duì)供應(yīng)方開票類型的選擇等等，其根源在于增值稅的多少直接關(guān)系到企業(yè)的利益。因此，增值稅如同企業(yè)存貨的進(jìn)價(jià)、職工薪酬一樣屬于企業(yè)的一項(xiàng)費(fèi)用。

1.8 GABA、cAMP含量和GAD活性測定

應(yīng)用雙抗體夾心法測定GABA、cAMP含量和GAD活性。分別用純化的GABA、cAMP和GAD抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入待測液,樣本中含有的GABA、cAMP和GAD與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過徹底洗滌后加底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理使用Excel 2010,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*代表在0.05水平差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇形態(tài)變化

通過套袋(高CO2濃度)和不套袋(正常CO2濃度)的方法,人為改變金針菇培養(yǎng)環(huán)境中CO2的濃度以考察CO2對(duì)其生長發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),套袋的金針菇(圖1A)菌柄正常伸長,但是菌蓋發(fā)育緩慢(圖1C);不套袋的金針菇菌柄伸長正常(圖1B),但是菌蓋開傘較早,發(fā)育較快(圖1D)。

2.2 蛋白質(zhì)含量變化

蛋白質(zhì)是組成一切細(xì)胞、組織的重要成分,與各種生命現(xiàn)象密切相關(guān)。通過測定,得到蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.003 3x-0.020 8,R2=0.991 1,說明數(shù)據(jù)可靠,可以用來計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量。如圖2所示,高CO2濃度條件下,金針菇與自然條件下生長的金針菇相比,二者在生長過程的I期、IV期蛋白質(zhì)含量相當(dāng),II期套袋的含量高,III期不套袋的含量稍高。

2.3 還原糖含量變化

還原糖是指具有還原性的糖類,含有游離醛基或酮基的單糖和含有游離醛基的二糖都具有還原性。通過測定標(biāo)準(zhǔn)曲線得到方程為:y=0.715 2x-0.022,R2=0.992 9,說明數(shù)據(jù)可靠,可以用來計(jì)算樣品還原糖含量。套袋種植的金針菇還原糖的含量在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅳ期與自然條件下的金針菇相差較小(圖3),Ⅲ期套袋的還原糖含量比自然生長的高。

圖2 不同時(shí)期蛋白質(zhì)含量Fig.2 Contents of protein in different periods

圖3 不同時(shí)期還原糖含量

2.4 多酚含量變化

多酚廣泛存在于自然界,其抗氧化功能可以對(duì)氧化損傷導(dǎo)致許多疾病起到預(yù)防和治療的作用。本實(shí)驗(yàn)測定的多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.008 1x-0.002 8,R2=0.990 5,說明數(shù)據(jù)可靠,可以用來計(jì)算樣品多酚含量。高濃度CO2條件下(圖4),金針菇的多酚含量在Ⅱ期和Ⅲ期升高,Ⅰ期和Ⅳ期與自然條件下的幾乎相同。

圖4 不同時(shí)期多酚含量

2.5 GABA含量變化

圖5 不同時(shí)期GABA含量

2.6 GAD活性變化

GAD酶的活性直接決定了GABA的含量。通過ELISA方法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=58.119x-0.014 9,R2=0.99,說明數(shù)據(jù)可靠,可以用來計(jì)算樣品中GAD活力。套袋種植的金針菇在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅳ期GAD活性與自然生長條件下的金針菇GAD活性相當(dāng),III期的活性比自然條件下高(圖6)。

圖6 不同時(shí)期GAD活性

2.7 cAMP含量變化

cAMP作為第二信使,可以激活下游很多條信號(hào)通路,引起機(jī)體的生理生化反應(yīng)。根據(jù)ELISA法測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=144.83x+0.060 5,R2=0.998 6,說明數(shù)據(jù)可靠,可以用來計(jì)算樣品中cAMP含量。在金針菇生長的Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期,兩種栽培條件下cAMP含量相差不大(圖7);Ⅰ期時(shí)自然生長條件下的金針菇cAMP含量高于套袋處理組。

圖7 不同時(shí)期cAMP活性

3 結(jié)論與討論

金針菇肉質(zhì)脆嫩，軟潤爽滑，味道鮮美，且富含蛋白質(zhì)、糖和多酚類等營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的食用和藥用價(jià)值?！吨腥A本草》中曾記載，金針菇性寒，具有補(bǔ)肝、益腸胃、抗癌的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥理學(xué)研究表明：金針菇能促進(jìn)兒童智力發(fā)育，有“增智菇”美譽(yù)。它能防治成人高血壓、胃潰瘍和肝臟疾病，抵抗疲勞，并且還具有一定的抗癌功效。因此，金針菇是百姓餐桌上常見的藥食同源的食用菌類食品，市場需求量很高。

栽培環(huán)境中，過高或過低的CO2濃度都會(huì)影響食用菌的生長發(fā)育，當(dāng)空氣中CO2濃度較高時(shí)，平菇、秀珍菇和猴頭菇會(huì)發(fā)育成珊瑚狀畸形菇；靈芝不形成菌蓋，菌柄分化成鹿角狀等。所以，適當(dāng)濃度的CO2對(duì)食用菌的生長發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。到目前為止，對(duì)于CO2調(diào)控食用菌子實(shí)體發(fā)育的機(jī)理研究主要有以下幾點(diǎn)：(1)某些種類的食用菌可以利用CO2作為其在基質(zhì)上定位子實(shí)體的信號(hào)[11-12]。靠近栽培基質(zhì)的空氣流動(dòng)慢，局部CO2濃度較高，影響孢子散布，抑制菌蓋擴(kuò)展，促進(jìn)菌柄伸長以尋找有利于子實(shí)體發(fā)育的低濃度CO2空間。(2)CO2與食用菌活性物質(zhì)合成相關(guān)[10]。CO2激發(fā)子實(shí)體產(chǎn)生活性因子，調(diào)控其生長發(fā)育；CO2還引起子實(shí)體內(nèi)某些物質(zhì)含量發(fā)生變化。(3)CO2抑制呼吸作用，調(diào)節(jié)菌絲體內(nèi)的貯藏化合物向結(jié)構(gòu)化合物轉(zhuǎn)化，從而影響子實(shí)體生長發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)的正常供給，進(jìn)而影響子實(shí)體的正常生長發(fā)育[13]。金針菇比較特殊，其主要食用部位是菌柄，所以菌柄的生物量取決于菌柄的伸長能力。在栽培過程中，發(fā)現(xiàn)：CO2濃度不同時(shí)，金針菇最為顯著的特征是形態(tài)的差異，高CO2濃度促使其呈現(xiàn)出較長的菌柄和較小的菌蓋形態(tài)。

通過測定金針菇的蛋白質(zhì)、還原糖和多酚的含量，發(fā)現(xiàn)：在生長發(fā)育的Ⅰ-Ⅳ期，當(dāng)CO2濃度較高時(shí)，蛋白質(zhì)含量在Ⅰ期不變，Ⅱ期升高；還原糖含量在Ⅰ和Ⅱ期降低，Ⅲ期升高；多酚類物質(zhì)Ⅰ期不變，而在Ⅱ和Ⅲ期升高。這說明，金針菇受到高濃度CO2調(diào)控后，糖類首先被消耗，使貯藏物質(zhì)變成能量物質(zhì)，為子實(shí)體基本生長發(fā)育提供能量和代謝中間產(chǎn)物；其次，蛋白質(zhì)類開始合成導(dǎo)致含量慢慢增加，而多酚類含量增加可能與其抗氧化功能有關(guān)。

除了貯藏物質(zhì)發(fā)生變化外，活性因子也對(duì)CO2濃度升高做出反應(yīng)。GABA作為一類信號(hào)分子，其含量較低，卻對(duì)高等植物發(fā)育過程(如植物的機(jī)械損傷，缺氧，干旱，耐鹽和抗寒脅迫等)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[14-15]。在番茄果實(shí)發(fā)育成熟過程中，GABA大量積累[16]，調(diào)節(jié)碳氮營養(yǎng)平衡。GABA通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)煙草的花粉管的生長[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度CO2脅迫下，GABA的含量在I到III期均低于正常對(duì)照組，Ⅳ期含量與對(duì)照組相當(dāng)。這說明該物質(zhì)在初期被消耗，發(fā)育的后期含量上升。GAD是催化GABA合成的關(guān)鍵酶，參與植物的衰老，種子的發(fā)育與成熟及植物對(duì)外界脅迫的應(yīng)激反應(yīng)等過程[18]，其活性直接與GABA的含量有關(guān)。在Ⅰ和Ⅱ期，GAD活性低于對(duì)照組，Ⅲ期GAD活力上升，從而使Ⅳ期的GABA含量上升至對(duì)照組水平。這些結(jié)果說明，GAD的活性可以被高濃度CO2所抑制，原因可能是GAD催化生成GABA的同時(shí)，還生成CO2，CO2反饋抑制GAD的活性。低含量的GABA可能促進(jìn)菌柄生產(chǎn)，抑制菌蓋開傘有關(guān)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，cAMP含量在兩種栽培條件下，變化不大，可能在金針菇發(fā)育過程中cAMP的作用較小。

綜上所述，在栽培過程中，高濃度CO2影響金針菇的蛋白質(zhì)，糖類和多酚類的含量變化，而且最先響應(yīng)的是糖類物質(zhì)；GABA含量和GAD活性呈現(xiàn)出先抑后揚(yáng)的模式，可能與菌柄伸長和菌蓋延遲開傘有關(guān)；cAMP含量變化較小，可能對(duì)菌柄伸長的貢獻(xiàn)較小。高濃度CO2調(diào)控GAD和GABA參與金針菇菌柄伸長的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。