響應(yīng)面法優(yōu)化女貞葉中三萜類成分的提取工藝

嚴(yán)小童, 馮承濤

(安徽理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，安徽 淮南 232000)

研究表明，三萜類化合物具有溶血、抗癌、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌抗病毒等多種治療作用[1-2]，但三萜類化合物難溶于水，提取工藝有待優(yōu)化。β-環(huán)糊精是一種具有特殊的呈閉合圓筒狀無臭，微甜，無毒的白色結(jié)晶粉末。其外表面是親水性的，內(nèi)部則是疏水性的管腔，其空間能包合住適當(dāng)大小的藥物分子，形成的包合物在水中有較大的水溶性，從而增加藥物的溶解度，改變藥物的特性[3-4]。β-環(huán)糊精分子可以與三萜類物質(zhì)的分子形成可溶于水的復(fù)合物，利用β-環(huán)糊精能夠有效的增大三萜類物質(zhì)的提取率。本文應(yīng)用響應(yīng)面法研究在不同因素下β-環(huán)糊精對女貞葉中三萜成分提取的輔助作用，以確定其最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 供試材料

女貞葉購于亳州中藥材大市場，經(jīng)安徽科技學(xué)院中藥教研室毛斌斌老師鑒定為為木犀科女貞屬植物女貞(LigustrumlucidumAit.)的葉；BSA124S電子分析天平(賽多利斯有限公司);UV-650型紫外分光光度計上海美譜達(dá)有限公司);齊墩果酸對照品(純度98%，安徽酷爾生物工程有限公司);其他試劑均為分析純，購于國藥試劑公司。

1.2 實驗方法

1.3 測定項目及分析方法

1.3.1 齊墩果酸最大吸收波長的確定和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg用甲醇溶解，置25 mL容量瓶中定容。分別吸取齊墩果酸對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分別置于10 mL具塞試管中，90 ℃水浴揮干溶劑后，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，60 ℃ 恒溫水浴顯色15 min后冷卻5 min，加冰醋酸稀釋至刻度，搖勻，用相同方法處理的溶液作為空白對照，用紫外分光光光度計測吸光度確定最大波長，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 女貞葉中三萜成分的提取與測定 取2 g干燥女貞葉粗粉和2 g β-環(huán)糊精置于100 mL具塞三角錐形瓶中，量取無水乙醇溶液30 mL,稱定重量，40 ℃下超聲處理1 h，搖勻底液，趁熱抽濾，將獲得濾液在80 ℃水浴鍋中蒸干揮發(fā)乙醇得浸膏，用適量甲醇溶解浸膏得均勻溶液，精密量取一定量的濾液進(jìn)行稀釋，加入適當(dāng)顯色劑在最大吸收波長處測吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程測定濾液中的三萜成分質(zhì)量濃度(C),計算三萜成分的提取率。

三萜成分的提取率 (mg/g)=C×n×V/M

其中式中C(mg/mL)為三萜成分的質(zhì)量濃度，n為濾液稀釋倍數(shù)，V(mL)為濾液體積，M(g)為供試女貞子粉末質(zhì)量。

1.3.3 單因素實驗考察設(shè)計 分別考察溶劑比(80%、75%、70%、65%、60% )、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取時間(20、30、40、50、60 min)、提取溫度(20、30、40、50、60 ℃)以及試樣量與β-環(huán)糊精之比(1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5)5個因素對三萜提取率的影響[8]，其中將β-環(huán)糊精作為一個因素探究其對三萜提取率的綜合影響，最后根據(jù)對提取的率的影響程度，選取四個顯著因素進(jìn)行響應(yīng)面分析[5-6]。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗設(shè)計 單因素試驗篩選出了作用最為顯著的四組，即溶劑比、料液比、提取溫度以及β-環(huán)糊精用量為自變量，女貞葉中三萜的提取率為響應(yīng)值，運用Design Expert 10.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。同時考察了溶劑比、料液比、提取溫度以及試樣量與β-環(huán)糊精之比交互作用對于女貞子三萜成分提取率的影響，并且建立各因素與提取率之間的數(shù)學(xué)模型[7-8]，實驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長及標(biāo)準(zhǔn)曲線

以齊墩果酸為指標(biāo)化合物，經(jīng)紫外最大波長掃描，確定其最大吸收波長為540 nm 。在540 nm處測各濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，以質(zhì)量濃度c(mg/mL)與吸光度值A(chǔ)建立回歸方程：A=57.727c-0.037 4，相關(guān)系數(shù)為0.996 0，線性范圍為0.003～0.015 mg/mL，其標(biāo)準(zhǔn)曲線詳見圖1。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 乙醇濃度對提取率的影響

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對提取率的影響 如圖2，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%～75%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，女貞葉中三萜成分的提取率呈現(xiàn)增長趨勢；在75%時達(dá)到最大值為3.82 mg/g，當(dāng)大于75%時三萜提取率則逐漸降低，因此可見在乙醇濃度控制在75%時最為合適。

2.1.2 料液比對提取率的影響 如圖3所示，料液比控制在1∶10～1∶25范圍內(nèi)時，隨著料液比不斷增加，三萜成分的提取率呈現(xiàn)增長的趨勢；在1∶40時達(dá)到最大值，三萜成分的提取率達(dá)到最大為3.68 mg/g;當(dāng)料液比超過1∶25時，三萜成分的提取率開始逐漸降低，因此控制料液比在1∶25左右合適。

圖3 料液比對提取率的影響

圖4 試樣量與β-環(huán)糊精之比對提取率的影響

2.1.3 β-環(huán)糊精對提取率影響 如圖4所示，當(dāng)試樣量與β-環(huán)糊精之比在1∶0.5～1∶1.5范圍內(nèi)，隨著β-環(huán)糊精量的增加，三萜成分的提取率呈現(xiàn)增長的趨勢；當(dāng)試樣量與β-環(huán)糊精的量之比為1∶1.5時，三萜成分的提取率達(dá)到最大，為4.23 mg/g;當(dāng)試樣量與β-環(huán)糊精之比大于1∶1.5時，三萜成分的提取率開始逐漸降低，因此試樣量與β-環(huán)糊精之比選擇1∶1.5比較合適。

2.1.4 提取溫度對提取率的影響 如圖5所示，提取溫度在20～50 ℃范圍內(nèi)時，提取率隨溫度的升高而升高；當(dāng)提取溫度在50 ℃時提取率達(dá)到最大，為3.66 mg/g;當(dāng)提取溫度超過50 ℃后，溫度升高，提取率下降，則最適宜的提取溫度為50 ℃。

圖5 提取溫度對提取率的影響

2.1.5 提取時間對提取率的影響 如圖6所示，提取率隨提取時間的變化而變化，當(dāng)提取時間為50 min時，提取率達(dá)到最大值3.63 mg/g。

圖6 提取時間對提取率的影響

2.1.6 綜合分析各因素對提取率的影響 通過單因素試驗綜合分析，可知β-環(huán)糊精的量對提取率的影響最為顯著，同時在實驗過程中可以觀察到β-環(huán)糊精大大提高了女貞葉中有效成分在甲醇中的溶解度，增大了其溶解的速率，縮短了所需溶解的時間；同時在5個因素中提取的時間對其提取率的影響不大可忽略。綜合各因素的影響效果可篩選出溶劑比，料液比，試樣量與β-環(huán)糊精之比和提取溫度4個因素對提取率的影響最為顯著，可以作為自變量進(jìn)行響應(yīng)面法分析。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗的結(jié)果與分析 根據(jù)響應(yīng)面法實驗設(shè)計，超聲提取女貞子中三萜成分的提取率見下表2：

采用Design Expert 10.0軟件對上表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸和二次多項方程擬合[9]，所得女貞葉三萜成分的提取率與溶劑比(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、試樣量與β-環(huán)糊精之比(D)二次多項回歸方程y=5.01+0.10×A+0.21×B+0.29×C+0.21×D-0.083×A×B+0.23×A×C+5.750-E003×A×D-0.20×B×C+0.11×B×D-0.13×C×D-0.60×A2-0.67×B2-0.33×C2-0.80×D2。如上所示，該回歸方程擬合效果好，失擬性不顯著，能很好地反映各因素對女貞葉中三萜類化合物提取率的影響。

表2 女貞子中三萜成分提取的響應(yīng)面法優(yōu)化實驗結(jié)果

表3 女貞葉三萜提取工藝響應(yīng)面回歸方程系數(shù)的方差分析

注：“*”表示顯著；“**”表示不顯著

模型中F=9.93，P<0.000 1，表明實驗所采用的二次模型是極其顯著的，在統(tǒng)計學(xué)上是非常有意義的。說明未知因素干擾極小，因此F值是可靠的?；貧w方程的決定系數(shù)R2值為0.908 5，說明有90.85%的相關(guān)性與自變量 三萜的提取率有關(guān)，所以該回歸方程能夠很好地說明各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，且同時有具體的數(shù)值大小進(jìn)行反映。則可以用此模型對女貞子中三萜類提取實驗的結(jié)果進(jìn)行預(yù)測和分析。

3 結(jié)論與討論

本次試驗利用超聲波提取法提取女貞葉中的三萜成分，探究β-環(huán)糊精對三萜成分的提取增溶作用以及最佳作用條件，首先將β-環(huán)糊精作為一個因素和其他因素一起進(jìn)行單因素實驗。篩選影響效果最顯著的4組通過響應(yīng)面分析法對女貞葉中三萜成分的工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過四因素三水平建立單因素與響應(yīng)值間的數(shù)學(xué)模型，研究結(jié)果表明最佳提取工藝條件為溶劑比為75%、料液比1∶25、試樣量與β-環(huán)糊精之比為1∶1.5 、提取溫度55 ℃，最佳提取率為5.115 30 mg/g，與預(yù)測值相差較小，因此可以得出β-環(huán)糊精能夠大大提高女貞葉中三萜的提取率，為今后三萜的工藝大量生產(chǎn)提供了有力的依據(jù)。女貞葉中三萜提取工藝多以齊墩果酸為評價指標(biāo)，已有部分研究是關(guān)于相應(yīng)面優(yōu)化女貞葉中有效成分的提取工藝，但對于本實驗研究的β-環(huán)糊精對三萜成分的輔助提取作用研究工藝尚未見有所報道，本實驗采用的響應(yīng)面法，避免了正交實驗的各種缺點，使優(yōu)化結(jié)果的數(shù)據(jù)更加精確。