穿心蓮內酯和雷公藤多苷抗炎作用的比較研究

劉寅寅， 鄒盼盼， 朱鶯鴿， 賀 焱， 張夢娟， 陳 超， 劉 暢， 李 磊

(安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100)

炎癥反應是多種疾病共同的發(fā)病基礎或病理過程,會造成局部或全身的損傷,嚴重時可危及生命。一些傳統(tǒng)中藥的提取物如雷公藤多苷和穿心蓮內酯抗炎效果較好。雷公藤多苷(tripterygium glycosides,TG)是從雷公藤根中提取的總苷,用于腎臟疾病[1]、重癥肝炎、紅斑狼瘡等疾病的治療,具有顯著的抗炎及免疫調節(jié)、抗腫瘤等作用[2],對類風濕疾病的治療效果甚佳[3],但由于其存在毒性,尤以肝毒性較大[4],限制了其臨床應用。穿心蓮內酯(andrographolide,Andro)作為穿心蓮中的主要有效成分,具有清熱解毒、去腫止痛、抗炎抗菌、抗病毒、免疫調節(jié)作用的同時,保肝利膽效果顯著[5-6]。因此,本研究將嘗試利用穿心蓮內酯保肝作用來改善雷公藤多苷的肝毒性,通過小鼠耳腫脹試驗、醋酸扭體試驗、熱板反應和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導炎癥模型來研究、比較穿心蓮內酯和雷公藤多苷單獨使用與配伍使用的抗炎效果,以期判斷兩者配伍的可行性和臨床應用價值,為穿心蓮內酯和雷公藤多苷配伍使用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 體重18～22 g的ICR小鼠,由安徽科技學院實驗動物中心提供,于室溫下飼養(yǎng),試驗期間小鼠自由進食、飲水。

1.1.2 藥品與試劑 羧甲基纖維素鈉(批號:F20050621)購于國藥集團化學試劑有限公司;穿心蓮內酯(批號:C10064882)購于上海麥克林生化科技有限公司;雷公藤多苷片(批號:171103)購于上海復旦復華藥業(yè)有限公司;醋酸地塞米松片(批號:160402)購于浙江仙琚制藥股份有限公司;二甲苯(批號:20170502)購于江蘇強盛功能化學股份有限公司;冰乙酸(批號:C10101190)購于上海麥克林生化科技有限公司;脂多糖(LPS,批號:813Q037)購于北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器設備 RB-200智能熱板儀 (成都泰盟科技有限公司);LE204E電子分析天平(梅特勒托利多儀器有限公司);IMS-70全自動雪花制冰機(常熟市雪科電器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 耳腫脹試驗 選擇30只小鼠適應性飼養(yǎng)7 d,隨機分為模型組、地塞米松組、雷公藤多苷組、穿心蓮內酯組、穿心蓮內酯和雷公藤多苷配伍組,每組6只。模型組按照0.1 mL/10 g灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液;地塞米松組按照2 mg/kg灌胃地塞米松;雷公藤多苷組按照30 mg/kg灌胃雷公藤多苷;穿心蓮內酯組按照20 mg/kg灌胃穿心蓮內酯;穿心蓮內酯和雷公藤多苷配伍組同時灌胃30 mg/kg的雷公藤多苷和20 mg/kg的穿心蓮內酯。連續(xù)灌胃5 d,于最后1 d灌胃結束1 h后,將每只小鼠右耳前后均勻涂抹0.02 mL二甲苯,30 min后,將小鼠頸椎脫臼處死,沿小鼠耳廓基線剪下雙耳,并用8 mm的打孔器分別于左右兩耳相同位置剪下一圓片,立即用分析天平準確稱量左右耳片重量,計算耳片腫脹抑制率。

耳片腫脹率(%)=(右耳片質量-左耳片質量)/左耳片質量×100%

耳片腫脹抑制率(%)=(模型組平均腫脹率-藥物組平均腫脹率)/模型組平均腫脹率×100%[7]

1.2.2 醋酸扭體試驗 取30只雌性ICR小鼠適應性飼養(yǎng)7 d,隨機分為空白組、地塞米松組(2 mg/kg)、雷公藤多苷組(30 mg/kg)、穿心蓮內酯組(20 mg/kg)、穿心蓮內酯和雷公藤多苷配伍組(20 mg/kg+30 mg/kg),每組6只?？瞻捉M按照0.1 mL/10 g灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,其余各組給予相應藥物,連續(xù)灌胃5 d,于最后1 d灌胃結束30 min后,按照0.1 mL/10 g給小鼠注射0.7%的醋酸溶液,觀察記錄20 min內小鼠扭體次數(shù),并計算鎮(zhèn)痛百分率。

鎮(zhèn)痛百分率(%)=[1-(給藥組平均扭體數(shù)/空白組平均扭體數(shù))]×100%

1.2.3 熱板試驗 小鼠分組與給藥同醋酸扭體試驗。連續(xù)灌胃5 d,最后1 d灌胃結束30 min后,將小鼠置于55±5 ℃的熱板儀測定其痛閾值(將小鼠放于熱板儀上至出現(xiàn)舔足和抖足的時間作為痛閾值(s)),共測定2次,取均值。如60 s仍然沒有反應,將小鼠取出,以免燙傷,其痛閾值算作60 s。

1.2.4 LPS誘導小鼠炎癥試驗 取ICR小鼠30只,雌雄各半,按照體重均衡隨機分為空白組、炎癥模型組、雷公藤多苷組(30 mg/kg)、穿心蓮內酯組(20 mg/kg)、穿心蓮內酯和雷公藤多苷配伍組(20 mg/kg+30 mg/kg),每組6只。炎癥模型組和空白組按照0.1 mL/10 g·b·w 灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,藥物用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制,每天灌胃1次,連續(xù)5 d。最后1 d灌胃30 min后,除空白組外,均按照5 mg/kg體重腹腔注射脂多糖,6 h后摘眼球取血,檢測其血常規(guī)和血液生化指標,觀察穿心蓮內酯與雷公藤多苷單獨及其配伍使用對LPS誘導炎癥小鼠的保護作用。

1.3 數(shù)據處理

結果以“平均值±標準誤”表示,采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據進行單因素ANOVA檢驗,多重比較采用LSD檢驗,P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 穿心蓮內酯和雷公藤多苷對小鼠耳腫脹率的影響

如表1所示,與模型組相比,雷公藤多苷組、穿心蓮內酯組均能顯著地抑制二甲苯所以引起的小鼠耳腫脹(P<0.05),地塞米松組、配伍組均能極顯著地抑制二甲苯所以引起的小鼠耳片腫脹(P<0.01);與雷公藤多苷組、穿心蓮內酯組相比配伍組雖能抑制二甲苯所以引起的小鼠耳片腫脹,但無顯著性差異。可見雷公藤多苷和穿心蓮內酯配伍使用,抗炎效果優(yōu)于穿心蓮內酯或雷公藤多苷單獨使用,但作用不明顯。

表1 穿心蓮內酯與雷公藤多苷對小鼠耳腫脹率的影響(n=6)

注:同列不同大、小寫字母分別表示在0.01和0.05水平上差異顯著。下同。

2.2 穿心蓮內酯和雷公藤多苷對小鼠醋酸扭體試驗的影響

如表2所示,與相比,地塞米松組能顯著降低小鼠扭體次數(shù)(P<0.05),雷公藤多苷組與穿心蓮內酯單獨應用及配伍使用均可極顯著地降低小鼠扭體次數(shù)(P<0.01);與雷公藤多苷組、穿心蓮內酯組相比,配伍組雖降低小鼠扭體次數(shù),但無顯著性差異。

表2 穿心蓮內酯與雷公藤多苷對小鼠扭體次數(shù)的影響(n=6)

2.3 穿心蓮內酯和雷公藤多苷對小鼠痛閾值的影響

如表3所示,與模型組相比,地塞米松組、雷公藤多苷組、穿心蓮內酯組,雷公藤多苷和穿心蓮內酯配伍組均能延長小鼠熱板反應的痛閾值;與雷公藤多苷組、穿心蓮內酯組相比配伍組能延長小鼠熱板反應的痛閾值,具有鎮(zhèn)痛效果。

表3 穿心蓮內酯與雷公藤多苷對小鼠痛閾值的影響(n=6)

2.4 穿心蓮內酯和雷公藤多苷對LPS誘導小鼠血清生理生化指標的影響

如表4所示,與空白組相比,經LPS誘導后的炎癥小鼠,血液中白細胞含量顯著升高(P<0.05),中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞含量極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,穿心蓮內酯和雷公藤多苷單獨應用或配伍組均能極顯著降低白細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞的含量(P<0.01);雷公藤多苷組或穿心蓮內酯組與配伍組相比無顯著性差異。

如表5所示,與空白組相比,經LPS刺激后小鼠血清中谷草轉氨酶含量顯著升高(P<0.05),谷丙轉氨酶、尿素氮、肌酐含量極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,穿心蓮內酯和雷公藤多苷單獨應用或配伍組均能顯著降低小鼠血液中谷草轉氨酶活力、尿素氮、肌酐的含量(P<0.05),極顯著降低谷丙轉氨酶的含量(P<0.01);雷公藤多苷組或穿心蓮內酯組與配伍組相比無顯著性差異。因此,與穿心蓮內酯配伍不能減弱雷公藤多苷的毒性。

表4 穿心蓮內酯和雷公藤多苷對LPS誘導的炎癥小鼠血液生理指標的影響(n=6)

表5 穿心蓮內酯和雷公藤多苷對LPS誘導的炎癥小鼠血液生化指標的影響(n=6)

3 結論與討論

炎癥的局部癥狀多是由于局部血管充血、炎性水腫、細胞變性、壞死等所導致的紅、腫、熱、痛、機能障礙。較嚴重時則引起全身反應,造成實質器官的損傷,在由細菌感染而引起的急性炎癥中,血液中白細胞數(shù)量明顯升高[8]。在本研究中LPS誘導小鼠全身炎癥反應的血常規(guī)檢測結果顯示,未給藥的小鼠經腹腔注射LPS致炎后,血液中各類白細胞數(shù)量極顯著升高(P<0.01),不論是穿心蓮內酯或雷公藤多苷單獨給藥,還是配伍使用,都能顯著或極顯著地降低血液中各類白細胞的數(shù)量,說明雷公藤多苷和穿心蓮內酯配伍使用和單獨使用同樣能起到較強的全身抗炎作用。

另外,本研究通過耳腫脹試驗、扭體試驗、熱板反應對小鼠模擬局部急性炎癥反應,結果表明,雷公藤多苷或穿心蓮內酯單獨使用可顯著抑制小鼠因二甲苯所致的耳腫脹率(P<0.05)。而雷公藤多苷和穿心蓮內酯配伍使用時,可極顯著地抑制小鼠因二甲苯所致的耳腫脹率(P<0.01)。可見雷公藤多苷和穿心蓮內酯配伍使用可極顯著地緩解小鼠因炎癥所致的紅、腫、熱、痛,抗炎效果較雷公藤多苷和穿心蓮內酯單獨使用好。

肌酐(CRE)是人體對肌肉的代謝產物,其代謝排除主要依靠腎小球的濾過作用,其含量可反應腎小球的濾過功能,當腎臟受到損傷時,血液中肌酐的含量會顯著提高[9];尿素氮(BUN)也通過腎小球濾過排出體外,當腎臟病變或受損時,血液中的尿素氮含量也會因代謝異常而提高[10]。谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)主要存在與肝細胞中,當肝臟受到損傷時,AST和ALT會釋放到血液中,使其在血液中的含量升高[11]。本試驗通過LPS誘導的小鼠全身炎癥反應試驗,檢測出雷公藤多苷和穿心蓮內酯配伍使用可以顯著減少小鼠血液中因炎癥而升高的肌酐、尿素氮、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶的含量,但與雷公藤多苷或穿心蓮內酯單獨使用的結果沒有顯著性差異,表明穿心蓮內酯和雷公藤多苷配伍不能減弱雷公藤的毒性。

研究發(fā)現(xiàn),雷公藤多苷和穿心蓮內酯配伍使用與單獨使用都具有較強的抗炎效果,且兩者配伍使用效果更好,但兩者單獨使用和配伍使用的抗炎效果不具有顯著性差異,無統(tǒng)計學意義。其次,與穿心蓮內酯配伍后,雷公藤多苷的毒性并未減弱。因此,治療炎癥反應時,單獨使用穿心蓮內酯或雷公藤多苷即可。