黃芪甲苷治療急性呼吸衰竭模型大鼠的效果及作用機(jī)制研究

屈高潔 廖玲 胡康

南華大學(xué)附屬第三醫(yī)院1呼吸內(nèi)科，2中醫(yī)康復(fù)科（湖南衡陽(yáng)421900）

急性呼吸衰竭是由于急性缺氧，以及二氧化碳發(fā)生潴留，紅細(xì)胞增多，血小板產(chǎn)生凝聚，導(dǎo)致血液的粘稠度增加［1-2］。黃芪甲苷是黃芪中的有效成分，具有抗氧化損傷作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對(duì)呼吸衰竭期出現(xiàn)的異常變化產(chǎn)生抵抗作用，阻止應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，改善肺功能［3］。目前臨床中急性呼吸衰竭的發(fā)病機(jī)制尚未明確，本研究主要探討黃芪甲苷治療急性呼吸衰竭模型大鼠的效果，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料研究動(dòng)物：選取選取22 只雄性、健康、清潔SD 大鼠，體質(zhì)量210～260 g，平均體質(zhì)量（235.5 ± 24.6）g，鼠齡10～12 個(gè)月，平均鼠齡（11.5±1.3）個(gè)月。由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有大鼠在無(wú)病原菌的干凈籠子里喂養(yǎng)，所飲用的水和食物均進(jìn)行過(guò)高溫以及高壓的消毒。本研究均經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 急性呼吸衰竭模型建立選取16 只大鼠建立急性呼吸衰竭模型。參考耿維鳳［5］模型建立并適當(dāng)進(jìn)行改正，將所有大鼠放在自制的常壓低氧氣高二氧化碳飼養(yǎng)艙內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)（10%O2，8%CO2），每天進(jìn)行12 h，連續(xù)2 周復(fù)制急性呼吸衰竭模型。其余6 只大鼠在正常的自然環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)2 周。

1.2.2 分組及給藥建模過(guò)程中死亡4 只，成功12 只，隨機(jī)分為模型組和黃芪甲苷組，各6 只，正常組6 只。黃芪甲苷組大鼠采用黃芪甲苷進(jìn)行治療，其服用劑量為5 mg∕kg，所以大鼠均采取灌胃的形式，5 mL∕kg，1 次∕d。模型組和正常組大鼠采用等體積的無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行灌胃，連續(xù)治療5 d。

1.2.3 肺功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)采用小動(dòng)物肺功能儀，檢測(cè)大鼠呼吸頻率、50%用力呼氣流量（50%forced expiratory flow，F(xiàn)EF50）、呼氣峰流速值（peak expiratory flow，PEF）肺功能指標(biāo)。將大鼠麻醉后間隔30 min，在手術(shù)臺(tái)上固定，抽取股動(dòng)脈血，保存在肝素鈉抗凝管中，每管2 mL，-20 ℃環(huán)境下保存，待測(cè)。

1.2.4 病理形態(tài)學(xué)觀察所有大鼠處死后，迅速提取大鼠肺組織，在10%的甲醛緩沖液中保持48 h，之后脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟處理后，采用HE進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察大鼠病理學(xué)特征。

1.2.5 動(dòng)脈血?dú)庀嚓P(guān)指標(biāo)檢測(cè)將采集到的標(biāo)本，取血清采用全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x檢測(cè)氫離子濃度（pH）、二氧化碳分壓（PaCO2）、氧分壓（PO2）動(dòng)脈血?dú)庀嚓P(guān)指標(biāo)。

1.2.6 AST、SOD、MDA 水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平。

1.2.7 Western Blot 檢測(cè)ACE2/Ang-（l-7）/Mas 通路蛋白將采集到的標(biāo)本，采用Western Blot 檢測(cè)分析ACE2∕Ang-（l-7）∕Mas 通路蛋白表達(dá)量。

表1 3 組大鼠肺功能相關(guān)指標(biāo)比較Tab.1 Comparisons of pulmonary function indexes in three groups of rats ±s

表1 3 組大鼠肺功能相關(guān)指標(biāo)比較Tab.1 Comparisons of pulmonary function indexes in three groups of rats ±s

注：與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05

組別正常組模型組黃芪甲苷組F 值P 值只數(shù)6 6 6呼吸頻率（次∕min）95.5±6.3 33.4±7.2*90.1±3.2*#23.849 0.000 FEF50（L∕s）39.42±2.23 27.01±2.95*32.26±2.81*#12.330 0.000 PEF（L∕s）39.44±2.82 29.55±2.58*35.62±1.08*#9.507 0.000

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（）進(jìn)行描述，多組間比較采用F值檢驗(yàn)，兩組間比較采用實(shí)施獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺功能相關(guān)指標(biāo)比較如表1所示，模型組呼吸頻率、FEF50、PEF 低于正常組和黃芪甲苷組（P ＜0.05）；黃芪甲苷組呼吸頻率、FEF50、PEF 低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.2 3組大鼠心肌細(xì)胞組織病理學(xué)觀察正常組肺泡結(jié)果完整，且肺泡大小均勻一致，肺泡腔內(nèi)干凈，肺泡間隔保持一致，并無(wú)增厚現(xiàn)象；支氣管上皮保持完整，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞炎性浸潤(rùn)以及毛細(xì)血管充血。模型組肺泡之間間隔增加，肺泡毛細(xì)血管壁發(fā)現(xiàn)充血，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有部分肺泡出現(xiàn)水腫。黃芪甲苷組肺泡腔內(nèi)干凈，細(xì)胞間隔未見(jiàn)增厚，細(xì)胞浸潤(rùn)程度降低，未見(jiàn)肺泡水腫，無(wú)毛細(xì)血管充血。見(jiàn)圖1。

圖1 3 組大鼠肺組織細(xì)胞病理學(xué)觀察（HE 染色，×100）Fig.1 Cytopathological observation of lung tissue in three groups of rats（HE staining，×100）

2.3 3組大鼠動(dòng)脈血?dú)庀嚓P(guān)指標(biāo)相關(guān)指標(biāo)比較模型組PaCO2壓高于正常組和黃芪甲苷組，pH、PO2低于正常組和黃芪甲苷組（P ＜0.05）；黃芪甲苷組pH、PaCO2高于正常組，PO2低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3 組大鼠動(dòng)脈血?dú)庀嚓P(guān)指標(biāo)相關(guān)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of related indexes of arterial blood gas in three groups of rats ±s

表2 3 組大鼠動(dòng)脈血?dú)庀嚓P(guān)指標(biāo)相關(guān)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of related indexes of arterial blood gas in three groups of rats ±s

注：與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05

組別正常組模型組黃芪甲苷組F 值P 值只數(shù)6 6 6 pH 7.27±0.05 7.10±0.04*7.36±0.06*#9.755 0.000 PaCO2（mmHg）35.88±3.01 56.51±2.96*47.16±2.88*#17.955 0.000 PO2（mmHg）112.34±9.95 65.52±6.02*90.40±5.01*#14.792 0.000

2.4 3組大鼠AST、SOD、MDA 水平比較模型組 AST 水平高于正常組和黃芪甲苷組，SOD、MDA 水平低于正常組和黃芪甲苷組（P ＜0.05）；黃芪甲苷組AST 水平高于正常組，SOD、MDA 水平低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 3 組大鼠AST、SOD、MDA 水平比較Tab.3 Comparison of AST，SOD and MDA levels in three groups of rats ±s

表3 3 組大鼠AST、SOD、MDA 水平比較Tab.3 Comparison of AST，SOD and MDA levels in three groups of rats ±s

注：與正常組相比，*P ＜0.05；與模型組相比，#P ＜0.05

組別正常組模型組黃芪甲苷組F 值P 值只數(shù)6 6 6 AST（U∕L）115.51±20.55 245.33±25.52*148.15±9.65*#14.558 0.000 SOD（U∕mL）240.10±10.45 115.31±10.12*225.14±5.09*#31.519 0.000 MDA（nmol∕mL）4.05±0.55 2.33±0.12*3.65±0.65*#11.226 0.000

2.5 3組大鼠ACE2/Ang-（l-7）/Mas 通路蛋白水平比較模型組ACE2、Ang-（l-7）、Mas 水平低于正常組和黃芪甲苷組（P ＜0.05）；黃芪甲苷組ACE2、Ang-（l-7）、Mas 水平低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

黃芪單體主要包含黃芪甲苷和黃芪多糖，現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪單體能提高機(jī)體免疫功能，具有保肝、抗菌、降壓、降血糖和抗應(yīng)激功效［4］。本研究中，黃芪甲苷組呼吸頻率、FEF50、PEF、pH、PO2升高，PaCO2降低，說(shuō)明黃芪甲苷可以促進(jìn)大鼠肺功能改善，對(duì)呼吸衰竭有抑制作用。病理學(xué)觀察中黃芪甲苷組肺組織細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞間隔擴(kuò)張程度降低。說(shuō)明黃芪甲苷可以改善大鼠病理癥狀，降低細(xì)胞間的炎性反應(yīng)，保護(hù)肺組織細(xì)胞不受損傷。研究顯示，呼吸衰竭的主要原因是肺泡水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織纖維增生，導(dǎo)致肺細(xì)胞間隔增厚，心肺功能下降［5-6］。

表4 3 組大鼠ACE2∕Ang-（l-7）∕Mas 通路蛋白水平比較Tab.4 Comparison of ACE2∕Ang-（l-7）∕Mas pathway protein levels in three groups of rats ±s

表4 3 組大鼠ACE2∕Ang-（l-7）∕Mas 通路蛋白水平比較Tab.4 Comparison of ACE2∕Ang-（l-7）∕Mas pathway protein levels in three groups of rats ±s

注：與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05

組別正常組模型組黃芪甲苷組F 值P 值只數(shù)6 6 6 ACE2 1.15±0.15 0.33±0.02*0.95±0.05*#19.910 0.000 Ang-（l-7）1.10±0.13 0.31±0.02*0.84±0.06*#22.068 0.000 Mas 1.16±0.11 0.43±0.06*0.94±0.08*#21.406 0.000

本研究中，黃芪甲苷組AST 水平降低，SOD、MDA 水平升高，說(shuō)明黃芪甲苷可以有效的改善大鼠AST、SOD、MDA 水平。SOD 通過(guò)減少超氧陰離子毒性作用，對(duì)酶起到保護(hù)作用，同時(shí)促進(jìn)機(jī)體中的O2-轉(zhuǎn)化成H2O2，防止O2-對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害［7］。SOD 有助于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，抑制化學(xué)趨向性因子激活，避免炎癥發(fā)生，有助于糖皮質(zhì)激素糖皮質(zhì)激素抗炎活性增強(qiáng)［8］。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在多種呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病中起到重要作用［9］。ACE2∕Ang-（l-7）∕Mas 受體軸在RAS 的中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用［10］。ACE2 通過(guò)分解AngII 促進(jìn)Ang-（l-7）生成，再由Mas 受體介導(dǎo)，發(fā)揮作用，ACE2∕Ang-（l-7）∕Mas 受體軸通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)，有助于降低血壓，起到松弛平滑肌的作用，抑制纖維化形成［11］。黃芪甲苷組ACE2∕Ang-（l-7）∕Mas 通路蛋白水平升高，說(shuō)明黃芪甲苷可以激活A(yù)CE2∕Ang-（l-7）∕Mas 通路，改善其相關(guān)蛋白水平。本文研究，黃芪甲苷通過(guò)激活A(yù)CE2∕Ang-（l-7）∕Mas 通路，促進(jìn)ACE2、Ang-（l-7）、Mas 水平升高，起到調(diào)節(jié)肺功能的作用，從而有效的抑制呼吸衰竭。ZHANG等［12］研究指出，ACE2∕Ang-（l-7）通路可以改善急性肺損傷模型中ER 應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本文研究ACE2∕Ang-（l-7）∕Mas 通 路在急性呼吸衰竭模型中同樣也發(fā)揮著重要作用，與其研究結(jié)果保持一致。

綜上所述，黃芪甲苷通過(guò)調(diào)控ACE2∕Ang-（l-7）∕Mas 通路蛋白，改善大鼠AST、SOD、MDA 水平，起到保護(hù)大鼠肺功能的作用。