p53蛋白O-乙酰氨基葡萄糖修飾介導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的順鉑耐藥

王漪 陳必良

空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院婦產(chǎn)科（西安710032）

癌細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)消耗增高導(dǎo)致細(xì)胞代謝失調(diào)是腫瘤的重要特征。在腫瘤細(xì)胞中，氨基己糖合成途徑代謝異?；钴S，利用葡萄糖、谷氨酰胺、乙酰輔酶A 和尿苷三磷酸最終生成尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）［1］。進(jìn)一步的，在β-N-乙酰葡萄糖胺糖基轉(zhuǎn)移酶（O-GlcNActransferase，OGT）作用下，將O-乙酰氨基葡萄糖（O-linked-β-Nacetylglucosomaine，O-GlcNAc）從UDP-GlcNAc 轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基，導(dǎo)致一種蛋白翻譯后修飾，稱為O-GlcNAc 糖基化修飾［2］。另一方面，β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷水解酶（O-GlcNAcase，OGA）負(fù)責(zé)將蛋白質(zhì)O-GlcNAc 糖基化移除。O-GlcNAc 糖基化修飾在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越多的被報(bào)道。近來研究［3］發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝癌和肺癌中，O-GlcNAc 糖基化水平均明顯升高。O-GlcNAc 糖基化可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖，并能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［4-5］。除此之外，在肺癌中，O-GlcNAc 糖基化水平升高能夠促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)［6］。有報(bào)道［7］顯示，原癌基因和抑癌基因的O-GlcNAc 糖基化修飾在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)中也發(fā)揮了重要作用，如p53。已有研究［8］顯示，在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)OGT 可導(dǎo)致癌基因蛋白E6 和E7 表達(dá)增加，而干擾OGT 表達(dá)則可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。近來，有研究［9］顯示NF-κB 蛋白的O-GlcNAc 糖基化可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，而抑制AMPK 的O-GlcNAc 糖基化則可導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞死亡［10-12］。因此，O-GlcNAc 糖基化在宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，以及臨床耐藥性中可能發(fā)揮重要作用。盡管如此，作為一種重要的抑癌基因蛋白，p53 的O-GlcNAc 糖基化修飾與宮頸癌進(jìn)展的關(guān)系，及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡和耐藥性的影響尚未有研究。因此，本研究旨在研究揭示p53 O-GlcNAc 糖基化水平與宮頸癌進(jìn)展的關(guān)系，以及p53 O-GlcNAc 糖基化在宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡，特別是順鉑抗性中的作用。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本收集本院宮頸癌I 期（CA I）臨床標(biāo)本8 例，宮頸癌Ⅱ期（CAⅡ）標(biāo)本8 例，宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅲ級(jí)（CINⅢ）標(biāo)本8 例，宮頸癌旁組織（CON）標(biāo)本8 例，-80 ℃保存，用于后續(xù)免疫組化和Western Blot 檢測(cè)。在患者知情同意下獲取臨床樣本，實(shí)驗(yàn)獲得本單位倫理委員會(huì)審批支持（批件號(hào)KY20163089-1）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理人宮頸癌C-33A 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，采用MEM-EBSS 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）培養(yǎng)，加入10%胎牛血清（Hyclone，美國(guó)）和1%青鏈霉素，37 ℃培養(yǎng)于5% CO2培養(yǎng)箱。細(xì)胞分為對(duì)照組（CON）、順鉑（DDP）處理組，順鉑和OGA 抑制劑TMG 處理組（DDP+TMG）、順鉑和OGT siRNA 干擾組（DDP+si-OGT）。順鉑（Biovision，美國(guó)）處理濃度50 μmol∕L，TMG（MCE，美國(guó)）濃度10 μmol∕L，均處理24 h。

1.3 siRNA 轉(zhuǎn)染人OGT 特異性siRNA 購(gòu)買于Santa Cruz 公司（美國(guó)）。將C-33A 細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80%融合時(shí)進(jìn)行siRNA 轉(zhuǎn)染。5 μL 的siRNA 加入100 μL 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基（Santa Cruz）混勻；另5 μL 的轉(zhuǎn)染試劑（Santa Cruz）加入100 μL 的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基混勻，將2 種液體混勻，室溫孵育45 min。用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，加入0.8 mL∕孔的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入上述siRNA 混合液，37 ℃培養(yǎng)6 h 后換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 免疫組化宮頸組織冰凍切片，厚度6 μm，室溫固定，蒸餾水漂洗后3% H2O2室溫孵育30 s。羊血清（中杉金橋，中國(guó)）室溫封閉1 h，滴加glycosylated p53 抗體（Detroit R&D，美國(guó)）（1∶100），4 ℃孵育過夜。PBS 沖洗后，滴加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠二抗（1∶1000，碧云天，中國(guó)），37 ℃孵育1 h。PBS 沖洗后，DAB 顯色后封片。

1.5 Western Blot凍存的宮頸組織和細(xì)胞加入RIPA 裂解液（碧云天）裂解，20 000 g，4 ℃離心，收取上清蛋白。SDS-PAGE 凝膠電泳后，250 mA、100 min 轉(zhuǎn)至PVDF 膜。glycosylated p53 一抗（1∶1 000）、p53 一抗（1∶1 000，碧云天）、OGT 一抗（1∶1 000，Abcom，美國(guó)）和Cleaved Capase-3 一抗（1∶1 000，Abcom）4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（1∶1 000，碧云天）室溫孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）中曝光檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞增殖采用CCK-8 試劑盒（同仁化學(xué)，日本）檢測(cè)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞處理24 h 后，按照說明書進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)表示為均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差。使用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，跟以Newman-Keuls分析檢測(cè)兩兩組間差異。以P值小于0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織中OGT 表達(dá)和p53 糖基化水平升高采用免疫組化檢測(cè)不同宮頸組織中p53 糖基化水平。由圖1A 可見，與癌旁組織相比，宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅲ級(jí)（CINⅢ）組織內(nèi)已可見p53糖基化水平的明顯升高。宮頸癌組織內(nèi)（CAⅠ，CAⅡ）p53 糖基化水平呈進(jìn)一步增高趨勢(shì)，并隨著宮頸癌分期進(jìn)展，p53 糖基化水平呈進(jìn)行性增高。進(jìn)一步地，western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CINⅢ組織內(nèi)OGT 表達(dá)已有顯著增加，而宮頸癌組織OGT 蛋白表達(dá)隨病理分期進(jìn)展進(jìn)行性升高（P＜0.05）（圖1B）。此結(jié)果表明，在癌前病變的CINⅢ級(jí)組織內(nèi)，OGT 表達(dá)增加和p53 糖基化水平升高已經(jīng)出現(xiàn)，宮頸癌組織內(nèi)p53 糖基化水平與癌癥進(jìn)展呈正相關(guān)，并可能源于OGT 表達(dá)增加導(dǎo)致的O-GlcNAc 糖基化。見圖1。

圖1 不同宮頸組織中p53 糖基化水平和OGT 表達(dá)變化Fig.1 The levels of p53 O-GlcNAcylation and OGT expression in different cervical tissues

圖2 TMG 所致p53 O-GlcNAc 糖基化介導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞順鉑抗性Fig.2 p53 O-GlcNAcylation induced by TMG increased the resistance of cervical cancer cells to cisplatin

2.2 p53 蛋白O-GlcNAc 糖基化引起宮頸癌細(xì)胞順鉑抗性增強(qiáng)采用OGA 特異抑制劑TMG 處理C-33A 細(xì)胞，抑制O-GlcNAc 糖基化去除活性，引起p53 O-GlcNAc 糖基化（gly-p53）水平升高（圖2A）。同樣，TMG 復(fù)合順鉑處理組（D+T）p53 糖基化水平較DDP 單獨(dú)處理組增高（圖2A）。DDP 處理引起C-33A 細(xì)胞caspase-3 剪切形式（Cl-Casp3）增加，而TMG 干預(yù)則降低了DDP 引起的caspase-3 剪切活化（圖2A）。此結(jié)果表明，p53 的O-GlcNAc 糖基化可拮抗DDP 導(dǎo)致的宮頸癌細(xì)胞凋亡。CCK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，DDP 處理導(dǎo)致了宮頸癌細(xì)胞活力降低，TMG 復(fù)合處理則可逆轉(zhuǎn)順鉑引起的宮頸癌細(xì)胞活力降低（圖2B）。見圖2。

2.3 抑制p53 蛋白O-GlcNAc 糖基化增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞順鉑敏感性為進(jìn)一步明確O-GlcNAc 糖基化p53 在順鉑所致宮頸癌細(xì)胞凋亡中的作用，采用siRNA 對(duì)C-33A 細(xì)胞OGT 表達(dá)進(jìn)行干擾。結(jié)果顯示，siRNA 干擾OGT（si-OGT）顯著降低了對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞p53 的O-GlcNAc 糖基化水平（圖3A）。DDP 處理顯著增加了宮頸癌細(xì)胞caspase-3 剪切體表達(dá)，而si-OGT 則進(jìn)一步增強(qiáng)了DDP 所致的C-33A 細(xì)胞caspase-3 剪切活化（圖3A）。細(xì)胞活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，si-OGT 引起了DDP 所致的細(xì)胞活力下降進(jìn)一步降低（圖3B）。這些結(jié)果表明，p53 的O-GlcNAc 糖基化水平降低可增強(qiáng)DDP 對(duì)宮頸癌細(xì)胞的致凋亡作用。見圖3。

圖3 OGT 表達(dá)抑制降低p53 O-GlcNAc 糖基化并增強(qiáng)順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞作用Fig.3 Inhibition of OGT decrease p53 O-GlcNAcylation and enhance effects of cisplatin on cervical cancer cells

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見惡性腫瘤，位于女性最常見癌癥死因的第4 位［13］。手術(shù)清除輔助同步放化療是目前宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，晚期宮頸癌的傳統(tǒng)治療策略是放療聯(lián)合順鉑化療［14］。順鉑是宮頸癌常用一線化療藥物，然而宮頸癌細(xì)胞容易對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，化療失?。?5］。因此，更深入理解化療時(shí)宮頸癌細(xì)胞凋亡抵抗的分子機(jī)制，有助于鑒別宮頸癌新的潛在治療靶點(diǎn)，改善治療效果。

近來，在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了O-GlcNAc 糖基化水平升高（hyper-O-GlcNAcylation），如乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝癌和肺癌，并在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮作用［3，16］。研究［9］顯示，多個(gè)分子的O-GlcNAc糖基化參與了腫瘤進(jìn)展，如NF-κB 的O-GlcNAc 糖基化可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。此外，熱休克蛋白27（Hsp27）的O-GlcNAc 糖基化修飾可促使MCF-7 細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［17］作為重要的抑癌蛋白，p53 已被證實(shí)在卵巢細(xì)胞中可被O-GlcNAc 糖基化修飾調(diào)控，并參與卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)和周期調(diào)節(jié)［18］。然而，p53 在宮頸癌的表達(dá)，及其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中，p53 糖基化水平升高，并與宮頸癌病理分級(jí)呈正相關(guān)。OGT 表達(dá)的同步升高表明p53 O-GlcNAc 糖基化在宮頸癌病情發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果提示了p53 O-GlcNAc糖基化和OGT 抑制作為宮頸癌臨床輔助治療的潛在可能。

O-GlcNAc 糖基化與腫瘤細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。在胰腺癌細(xì)胞中，高O-GlcNAc 糖基化顯示出抗凋亡特性，并使NF-κB持續(xù)保持高活性。另一個(gè)研究［19］顯示，在乳腺癌細(xì)胞中抑制OGT 活性，則可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，表明高O-GlcNAc 糖基化阻止了乳腺癌細(xì)胞的凋亡。另一方面，O-GlcNAc糖基化還被證實(shí)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。腫瘤抑制因子FOXO3 的O-GlcNAc 糖基化引起了人胰腺癌細(xì)胞的異常增殖，這種促增殖作用源于FOXO3的O-GlcNAc 糖基化阻斷了p53 的調(diào)控作用［20］。在肝癌細(xì)胞中，β-連環(huán)蛋白（beta-catenin）發(fā)生O-GlcNAc 糖基化導(dǎo)致了肝癌細(xì)胞的增殖、克隆形成，并抑制了肝癌細(xì)胞凋亡［21］。p53 在細(xì)胞中發(fā)揮多種重要調(diào)控作用，如細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA 損傷反應(yīng)、細(xì)胞衰老和誘導(dǎo)凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，p53 蛋白O-GlcNAc 糖基化導(dǎo)致了宮頸癌細(xì)胞凋亡減少和增殖能力升高，并可阻斷順鉑引起的宮頸癌細(xì)胞凋亡和增殖降低。與本研究結(jié)果一致，在肺癌細(xì)胞的研究也證實(shí)，肺癌細(xì)胞的順鉑抗性與O-GlcNAc糖基化p53 有關(guān)［2］。這些結(jié)果表明，p53 O-GlcNAc糖基化可能是宮頸癌細(xì)胞發(fā)生順鉑化療耐藥的重要原因，為改善宮頸癌化療耐藥提供了一個(gè)可能靶標(biāo)。

通常情況下，p53 在E3 泛素連接酶MDM-2 作用下發(fā)生泛素化，經(jīng)蛋白酶體催化降解。有研究顯示，在細(xì)胞中過表達(dá)OGT 可導(dǎo)致MDM-2 表達(dá)和磷酸化水平的升高［18］。此結(jié)果表明，p53 的O-GlcNAc 糖基化可能通過促進(jìn)p53 的泛素蛋白酶體降解，進(jìn)而促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的增殖并降低凋亡發(fā)生。肺癌細(xì)胞中p53 的O-GlcNAc 糖基化可促進(jìn)p53 蛋白的泛素化和蛋白酶體水解［2］。然而，在乳腺癌細(xì)胞中的研究顯示，p53 在Ser 149 位點(diǎn)的O-GlcNAc 糖基化促進(jìn)了p53 蛋白的穩(wěn)定［21］。并且，另一研究顯示O-GlcNAc 糖基化可穩(wěn)定并激活p53 途徑，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖［18］。這種差異可能源于不同位點(diǎn)O-GlcNAc 糖基化的作用不同，因?yàn)閜53 含有多個(gè)O-GlcNAc 糖基化位點(diǎn)［20］。并且上述O-GlcNAc 糖基化對(duì)p53 的穩(wěn)定作用主要通過降低Thr155 的磷酸化而實(shí)現(xiàn)，但順鉑的主要作用位點(diǎn)為Ser15［2］。盡管如此，p53 O-GlcNAc 糖基化在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，特別是其發(fā)生位點(diǎn)和機(jī)制應(yīng)被進(jìn)一步研究探索，為解決宮頸癌化療耐藥性提供更準(zhǔn)確的目標(biāo)［22］。